人GJB6基因突變對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖與凋亡的影響和機(jī)制.pdf

1、目的:
　　有汗性外胚葉發(fā)育不良(hidrotic ectodermal dysplasia，HED)是一種常染色體顯性外胚葉發(fā)育不良疾病。當(dāng)編碼Cx30縫隙連接蛋白的GJB6基因發(fā)生突變時(shí)，可引起耳聾和有汗性外胚葉發(fā)育不良。本研究中，以Tet-on慢病毒為載體建立穩(wěn)定表達(dá)GJB6基因及其突變體的HaCaT細(xì)胞株，進(jìn)一步了解GJB6基因突變引起HaCaT細(xì)胞凋亡的機(jī)制，初步探究GJB6基因突變體引起HED不同臨床表型的可能機(jī)制。<

2、br>　　方法:
　　利用PCR技術(shù)擴(kuò)增人GJB6基因野生型與突變型(A88V、G11R)基因，重組Tet-on慢病毒質(zhì)粒，經(jīng)基因測(cè)序及酶切技術(shù)對(duì)其鑒定，再將重組慢病毒轉(zhuǎn)染入HaCaT細(xì)胞，經(jīng)puromycin篩選出穩(wěn)定表達(dá)編碼縫隙連接蛋白Cx30的GJB6基因的細(xì)胞株。細(xì)胞株加四環(huán)素(DOX)誘導(dǎo)后，通過RT-PCR檢測(cè)GJB6基因的mRNA表達(dá)量，同時(shí)通過Western blot檢測(cè)Cx30的表達(dá)，從而對(duì)穩(wěn)定表達(dá)GJB6基因的

3、HaCaT細(xì)胞株進(jìn)行鑒定。用CCK8法檢測(cè)GJB6基因野生型與突變型經(jīng)DOX誘導(dǎo)表達(dá)后對(duì)細(xì)胞增殖的影響。利用流式細(xì)胞分析法檢測(cè)加DOX誘導(dǎo)基因表達(dá)后對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡的影響。通過Western blot檢測(cè)HED相關(guān)臨床表型指標(biāo)和相關(guān)凋亡指標(biāo)的蛋白水平的變化。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定重組慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功。RT-PCR檢測(cè)到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HaCaT細(xì)胞中GJB6基因的mRNA表達(dá)量明顯增加，WT（加四環(huán)素）組GJB6

4、基因表達(dá)豐度是WT（不加四環(huán)素）組的113.369倍(P＜0.05);A88V（加四環(huán)素）組GJB6基因表達(dá)豐度是A88V（不加四環(huán)素）組的3.249倍(P＜0.05);G11R（加四環(huán)素）組GJB6基因表達(dá)豐度是G11R（不加四環(huán)素）組的32.011倍(P＜0.05);Western blot可檢測(cè)到經(jīng)DOX處理的WT組和A88V組、G11R組穩(wěn)定表達(dá)Cx30，而未經(jīng)DOX處理的細(xì)胞和NC組細(xì)胞未檢測(cè)到Cx30目的條帶。NC組:加入四

5、環(huán)素與不加入四環(huán)素在各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)(4、8、12、24、36、48h)吸光度值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;WT組:加入四環(huán)素與不加入四環(huán)素在以下時(shí)間節(jié)點(diǎn)(4、8、12、24、36h)吸光度值存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;A88V組:加入四環(huán)素與不加入四環(huán)素在各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)(4、8、12、24、36、48h)吸光度值均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;G11R組:加入四環(huán)素與不加入四環(huán)素在各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)(4、8、12、24、36、48h)吸光度值均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。流式細(xì)胞分析法檢測(cè)到相比N

6、C組、WT組，A88V、G11R組明顯降低了細(xì)胞的增值率，導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞的凋亡，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05。加入四環(huán)素誘導(dǎo)后，GJB6基因突變型A88V、G11R可引起內(nèi)披蛋白表達(dá)量降低，絲聚蛋白、角蛋白K6b、兜甲蛋白表達(dá)量無明顯變化。凋亡指標(biāo)Bcl-2、Bax的表達(dá)量無明顯改變;Caspase3、Caspase8、Caspase9、PARP等凋亡相關(guān)指標(biāo)可見其剪切體。
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建出穩(wěn)定表達(dá)GJB6基因野生