漢防己甲素聯(lián)合5-氟尿嘧啶殼聚糖微球防治實(shí)驗(yàn)性PVR的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:1.研究Tet與5-Fu對(duì)兔眼體外RPE細(xì)胞增殖的抑制作用,并探討其抑制兔RPE細(xì)胞增殖的作用機(jī)制,以期初步評(píng)價(jià)藥物防治PVR的可行性問(wèn)題。
　　2.觀察Tet聯(lián)合5-Fu殼聚糖微球(Tet-5-FU-CS-MS)對(duì)實(shí)驗(yàn)性兔眼PVR模型的防治效果,研究藥物在眼內(nèi)的抗炎機(jī)制。
　　方法:1.提取培養(yǎng)兔RPE細(xì)胞,傳至第四代并鑒定后,選取生長(zhǎng)良好的第四代RPE細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。設(shè)Tet分為2、5、10、15μg/mL組及空白對(duì)

2、照組(1O％FBS-DMEM,含0.5%oDMSO, DMSO終濃度≤1‰,對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用)。5-Fu為5、10、15、20μg/mL組及空白對(duì)照組(同上)。噻唑藍(lán)比色(MTT)法檢測(cè)兩組藥物對(duì)RPE細(xì)胞增殖的抑制率,從而測(cè)定出增殖抑制率較高而藥物濃度相對(duì)較低的最佳有效濃度;流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)最佳有效濃度的兩組藥物及空白對(duì)照組作用72h后對(duì)RPE細(xì)胞周期的影響;流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)最佳有效濃度兩組藥物及空白對(duì)照組分別作用24

3、h、48h、72h、96h后對(duì)RPE凋亡率、線粒體跨膜電位(ΔΨm)、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度、Bax, Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。
　　2.健康成年青紫藍(lán)兔48只,隨機(jī)分為A、B、C三組,每組16只兔32眼,建立兔眼外傷性PVR模型,向玻璃體中后部注入藥物,A組注入含有Tet-5-FU-CS-MS的BSS懸浮液0.2ml,B組注入含有5-Fu聚乳酸微球的BSS懸浮液0.2ml,C組注入25mg無(wú)藥物殼聚糖微球的BSS懸浮液0.2ml

4、,術(shù)后每天觀察眼底變化,必要時(shí)行眼科B超檢查直到注藥后第28天,藥效評(píng)價(jià)按Ryan分級(jí)法,觀察各組視網(wǎng)膜脫離的發(fā)生率。分別于術(shù)后7天、14天、28天等3個(gè)時(shí)間點(diǎn)抽取各術(shù)眼玻璃體液0.2ml,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)玻璃體液中TNF-α. IL-1β的含量。
　　成果:1.Tet與5-Fu明顯抑制兔體外RPE細(xì)胞的增殖,呈時(shí)間和劑量依賴性,除作用96h后,Tet1O、15μg/ml及5-Fu15,20μg/ml之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

5、義外,其余各質(zhì)量濃度及時(shí)間點(diǎn)之間的比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05),分別選取RPE細(xì)胞的增殖抑制率較高而藥物濃度相對(duì)較低的Tet10μg/ml)組和5-FU(15μg/ml)組進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。Tet與5-Fu兩組RPE細(xì)胞在72h時(shí)G0/G1(合成前期)細(xì)胞明顯增多,與相應(yīng)空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); Tet與5-Fu兩組各時(shí)間點(diǎn)RPE細(xì)胞凋亡率與相應(yīng)對(duì)照組相比明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);隨時(shí)間延

6、長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)組RPE細(xì)胞線粒體ΔΨ逐漸降低,與相應(yīng)對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);隨時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度逐漸升高,與相應(yīng)對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Tet(10μg/ml)及5-Fu(15μg/ml)實(shí)驗(yàn)組與相應(yīng)空白對(duì)照組相比,均出現(xiàn)Bax蛋白表達(dá)增加,Bcl2蛋白表達(dá)下降,Bcl-2/Bax比值下降,兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.Tet-5-FU-CS-MS組與5-Fu聚乳酸

7、微球組及空白微球組相比,各時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜脫離的發(fā)生率明顯降低,其玻璃體液中TNF-α、IL-1B等炎性因子的含量也顯著低于其它兩組,方差分析p＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:1.Tet與5-Fu對(duì)體外兔RPE細(xì)胞的增生有明顯抑制作用,通過(guò)阻斷RPE細(xì)胞增生周期,干擾Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)而誘導(dǎo)RPE細(xì)胞凋亡,兩藥聯(lián)用在防治PVR方面具有潛在價(jià)值。
　　2.Tet-5-FU-CS-MS顯著降低實(shí)驗(yàn)性兔眼PVR的發(fā)生