質(zhì)粒PSN在OVA誘導(dǎo)小鼠模型中的抗哮喘研究.pdf

1、研究背景
　　過敏性哮喘被認(rèn)為是Th2免疫應(yīng)答占優(yōu)勢的Th1/Th2失衡的復(fù)雜疾病。研究發(fā)現(xiàn)Th2類型的細(xì)胞因子，如IL-4、IL-5、IL-13能促進(jìn)和維持哮喘的癥狀，在哮喘的發(fā)病過程中具有關(guān)鍵的作用，已成為抗哮喘治療的靶點(diǎn)。但歸因于哮喘發(fā)病中存在的復(fù)雜的信號補(bǔ)償機(jī)制，僅僅將單個Th2類型細(xì)胞因子，例如IL-4，作為哮喘治療靶點(diǎn)的生物制劑在臨床實(shí)驗中均未取得顯著效果。已有報道顯示，某些微生物病原體的產(chǎn)物具有激活固有免疫系統(tǒng)，進(jìn)而

2、調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫應(yīng)答失衡的能力，在抗哮喘研究中具有很大潛力。本研究假設(shè)，同時應(yīng)用具有上調(diào)Th1免疫應(yīng)答能力的幽門螺旋桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白(HP-NAP)和具有阻斷IL-4生物學(xué)功能的可溶性白介素4受體(sIL-4R)，去調(diào)節(jié)多個與哮喘發(fā)病機(jī)制相關(guān)的Th1或Th2類型細(xì)胞因子，可能獲得更好的抗哮喘效果。本研究成功構(gòu)建了融合表達(dá)sIL-4R和HP-NAP的質(zhì)粒PSN，在OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型上對其抗哮喘效果進(jìn)行了評估并探討了相關(guān)抗

3、哮喘機(jī)制。
　　方法
　　1.構(gòu)建融合表達(dá)HP-NAP和sIL-4R的質(zhì)粒pcDNA3.1-sIL-4R-NAP（命名為PSN），HP-NAP和sIL-4R編碼基因用柔性肽(GSGGSG)的編碼序列相連。質(zhì)粒PSN瞬時轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，RT-PCR及WesternBlot鑒定融合蛋白sIL-4R-NAP的表達(dá)。
　　2.建立OVA誘導(dǎo)的BALB/c小鼠哮喘模型，用于評估質(zhì)粒PSN的抗哮喘效果及探討其作用機(jī)制。

4、　　3.最后一次OVA霧化處理24小時后，處死小鼠，進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，計數(shù)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞數(shù)目。并進(jìn)行肺組織切片H&E染色，評估氣道炎癥情況。
　　4.ELISA檢測BALF中IL-4和IFN-γ的表達(dá)水平和血漿中OVA特異性IgE的濃度。
　　5.qRT-PCR檢測小鼠肺組織中與哮喘發(fā)病相關(guān)的細(xì)胞因子(IL-5、IL-12、IL-13)、趨化因子(eotaxin-1、eo

5、taxin-2、CXCL2、CXCL5)及炎癥因子（IL-6、TNF-α、IL-17A)的mRNA水平。
　　6.qRT-PCR檢測肺組織中與免疫抑制相關(guān)的IL-10和Foxp3的mRNA水平。
　　結(jié)果
　　1.RT-PCR和WesternBlot結(jié)果顯示HP-NAP和sIL-4R以融合蛋白(sIL-4R-NAP)的形式表達(dá)于COS-7細(xì)胞中，并可分泌到細(xì)胞外。
　　2.質(zhì)粒PSN能明顯減輕小鼠哮喘癥狀、肺部炎

6、癥顯著減弱。BALF細(xì)胞總數(shù)及BALF中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目顯著減少，中性粒細(xì)胞數(shù)目無明顯改變。
　　3.質(zhì)粒PSN顯著降低Th2類型細(xì)胞因子(IL-5、IL-13)和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子eotaxin-2的mRNA水平，但對中性粒細(xì)胞趨化因子(CXCL2、CXCL5)、炎癥因子（IL-6、TNF-α、IL-17A）以及免疫抑制相關(guān)因子(IL-10、Foxp3)的mRNA水平未產(chǎn)生明顯的影響。
　　4.質(zhì)粒PSN顯著提升BALF

7、中IFN-γ的表達(dá)水平，顯著降低BALF中IL-4和血漿IgE水平。
　　結(jié)論
　　質(zhì)粒PSN能逆轉(zhuǎn)Th2免疫應(yīng)答占優(yōu)勢的Th1/Th2漂移、顯著抑制氣道炎癥、減少BALF的細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目、極顯著的降低血漿IgE水平和肺組織中嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子eotaxin-2的mRNA水平。但質(zhì)粒PSN不影響中性粒細(xì)胞在BALF中所占百分比、不影響肺組織中炎癥因子的mRNA水平，并且其抗哮喘效果不依賴Treg亞群的免疫抑制作