鹽酸甜菜堿對(duì)HHcy大鼠腦組織和原代海馬細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　研究鹽酸甜菜堿(Bet)對(duì)高同型半胱氨酸血癥(HHcy)大鼠腦組織和原代海馬細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。通過(guò)對(duì)HHcy大鼠血漿及腦組織勻漿中的SOD活性、LDH活性、MDA、NO及GSH含量進(jìn)行測(cè)定，HE染色觀察HHcy大鼠腦組織形態(tài)學(xué)等方法研究Bet的保護(hù)作用。體外實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率和凋亡率，采用試劑盒測(cè)定細(xì)胞上清液SOD活性、MDA含量、LDH活性和細(xì)胞凋亡，Western Blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bc

2、l-2和Bax的表達(dá)，探討B(tài)et拮抗Hcy致大鼠原代培養(yǎng)海馬細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.Bet對(duì)HHcy大鼠腦組織的保護(hù)作用:采用2％蛋氨酸飼料喂養(yǎng)Wistar大鼠，制備大鼠高同型半胱氨酸血癥模型。分組如下:正常對(duì)照組（標(biāo)準(zhǔn)飼料，生理鹽水）、模型組(HHcy)（高蛋氨酸飼料，生理鹽水），鹽酸甜菜堿高、中、低濃度組(高蛋氨酸飼料，甜菜堿劑量200、100、50mg/Kg)，大鼠尾部取血離心取血清，檢測(cè)大鼠血清同型

3、半胱氨酸的含量。灌胃Bet60天后麻醉處死，檢測(cè)血漿及腦組織勻漿SOD、MDA、NO、GSH、LDH及NO水平，HE染色觀察大鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化。
　　2.Bet對(duì)原代培養(yǎng)大鼠海馬細(xì)胞的保護(hù)作用:采用低濃度胰蛋白酶消化靜置提取海馬細(xì)胞，高糖DMEM培養(yǎng)原代海馬細(xì)胞的方法。原代海馬細(xì)胞分組如下:正常對(duì)照組:高糖DMEM培養(yǎng)基;同型半胱氨酸(Hcy)損傷組（模型組）:16mmol/LHcy;鹽酸甜菜堿高中低濃度組:16mmol/L H

4、cy+12.5mmol/L Bet(25mmol/L Bet，50mmol/LBet)。甜菜堿各組在Hcy損傷前Bet預(yù)處理12h，Hcy作用12h，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖。藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率及試劑盒細(xì)胞上清液中LDH的釋放，氧化應(yīng)激指標(biāo)采用比色法檢測(cè)細(xì)胞上清液中SOD活性和MDA含量。Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax的表達(dá)。
　　結(jié)果：

5、>　　1.Bet對(duì)HHcy大鼠腦組織的保護(hù)作用:利用高蛋氨酸飼料飲食建造大鼠高同型半胱氨酸血癥動(dòng)物模型。利用鹽酸甜菜堿灌胃治療，結(jié)果鹽酸甜菜堿組血漿及腦組織SOD、MDA、NO、GSH的變化與模型組比較均變化顯著(P＜0.01); HE染色結(jié)果表明甜菜堿組與模型組相比，模型組腦組織病理狀態(tài)明顯得到改善，明顯保護(hù)受損的腦組織。
　　2.Bet對(duì)原代培養(yǎng)大鼠海馬細(xì)胞的保護(hù)作用:建立體外培養(yǎng)海馬細(xì)胞的方法并且鑒定成功，同型半胱氨酸損傷濃

6、度為16mmol/L，鹽酸甜菜堿的保護(hù)濃度分別為12.5、25、50mmol/L，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率甜菜堿組細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，MTT法結(jié)果與模型組比較，Bet各組細(xì)胞死亡率降低，Western-blot法結(jié)果與模型組比較，Bet組升高Bcl-2蛋白的表達(dá)、降低Bax蛋白的表達(dá)，具有顯著性差異。
　　結(jié)論：
　　1.建立大鼠高同型半胱氨酸血癥動(dòng)物模型。
　　2.與對(duì)照組比較，

7、高同型半胱氨酸血癥模型大鼠的大腦皮質(zhì)和海馬組織有明顯的病理變化，甜菜堿組的組織病理狀態(tài)與模型組比較損傷減輕。表明甜菜堿對(duì)高同型半胱氨酸所致的腦組織損傷具有保護(hù)作用。
　　3.高同型半胱氨酸血癥模型大鼠與正常對(duì)照組比較，血漿與腦組織中SOD活性降低，同時(shí)GSH含量減少，MDA和NO水平明顯增高，甜菜堿組與模型組比較血漿與腦組織勻漿中SOD活性和GSH含量明顯提高，MDA和NO水平下降。表明甜菜堿保護(hù)同型半胱氨酸損傷的機(jī)制可能是通過(guò)提

8、高腦組織抗氧化能力途徑發(fā)揮作用。
　　4.建立體外提取、培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)細(xì)胞的方法并且鑒定成功。低濃度Hcy可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，高濃度Hcy可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡;Bet能夠降低Hcy誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡率，降低Hcy對(duì)神經(jīng)元造成的損傷。
　　5.Bet可以提高同型半胱氨酸損傷的神經(jīng)細(xì)胞SOD活力，降低同型半胱氨酸損傷的細(xì)胞MDA含量，通過(guò)降低氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)保護(hù)高同型半胱氨酸對(duì)原代海馬細(xì)胞的損傷。