體外三維環(huán)境下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞及其極化特征.pdf

1、研究背景和目的：
　　 終末期慢性肝病，尤其是急性肝功能衰竭，發(fā)病率及死亡率均較高。肝移植是目前確實(shí)有效的治療手段，但由于供體器官的缺乏，僅少于30％的肝病患者可獲得肝移植。肝細(xì)胞治療可作為肝移植的替代輔助治療，然而其局限性在于人肝細(xì)胞來源缺乏。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSC)在體外肝細(xì)胞生長因子等刺激作用下可分化為具有合成和分泌白蛋白及多種肝細(xì)胞代謝產(chǎn)物的肝細(xì)胞樣細(xì)胞，可作為

2、肝細(xì)胞治療的新細(xì)胞來源。以往研究多采用平面二維細(xì)胞培養(yǎng)體系，誘導(dǎo)分化細(xì)胞呈單層生長，與體內(nèi)細(xì)胞生理環(huán)境所處的三維環(huán)境顯著不同。近年來，細(xì)胞三維培養(yǎng)方式逐漸應(yīng)用于組織再生和腫瘤侵襲等領(lǐng)域，Ⅰ型鼠尾膠原蛋白可模擬體內(nèi)細(xì)胞生長所需的細(xì)胞外基質(zhì)，是最常用的三維細(xì)胞誘導(dǎo)體系。已有報道胚胎干細(xì)胞在膠原蛋白三維誘導(dǎo)體系下可分化為體內(nèi)多種胚胎樣組織結(jié)構(gòu)，為未來器官再生研究奠定基礎(chǔ)。肝細(xì)胞是體內(nèi)高度極化的細(xì)胞。肝細(xì)胞的極化特征對于肝細(xì)胞發(fā)揮正常功能至關(guān)重

3、要。成人BMSC在三維培養(yǎng)體系中能否完成向肝細(xì)胞分化，并形成肝細(xì)胞特征性的極化結(jié)構(gòu)，目前尚未可知。本研究應(yīng)用膠原蛋白三維培養(yǎng)體系將成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞，并以此為模型，深入研究肝細(xì)胞極化產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)和形態(tài)、功能特征，探討肝細(xì)胞極化形成所需的細(xì)胞外基質(zhì)條件及主要影響因素，為臨床治療由肝細(xì)胞極化紊亂引發(fā)的各種肝病提供理論基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 一．從成人骨髓中分離出BMSC，同時利用普通平面二維細(xì)

4、胞培養(yǎng)和膠原蛋白三維培養(yǎng)體系進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。用倒置顯微鏡觀察平面培養(yǎng)體系下誘導(dǎo)分化來源的肝細(xì)胞在不同時期的形態(tài)學(xué)變化。用HE染色法觀察三維培養(yǎng)條件下分化肝細(xì)胞的形態(tài)及結(jié)構(gòu)特征。用免疫熒光法觀察肝細(xì)胞特異性蛋白ALB在平面培養(yǎng)分化來源肝細(xì)胞的特征性表達(dá)。用免疫組化法檢測肝細(xì)胞特異性蛋白ALB和AFP在膠原蛋白三維誘導(dǎo)分化來源肝細(xì)胞的特征性表達(dá)來證實(shí)成人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化過程中肝細(xì)胞特異性標(biāo)志物產(chǎn)生。
　　 二．用免

5、疫熒光染色方法分別觀察SRBI和BSEP等極化標(biāo)志性蛋白在BMSC二維誘導(dǎo)分化來源肝細(xì)胞和膠原蛋白三維誘導(dǎo)分化來源肝細(xì)胞的特征性表達(dá)，是否形成特征性的極化結(jié)構(gòu)及膽管樣結(jié)構(gòu)，應(yīng)用小鼠肝原代細(xì)胞“三明治”培養(yǎng)極化模型作為陽性對照。
　　 研究結(jié)果：
　　 一．和以往研究結(jié)果一致，成人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)平面培養(yǎng)誘導(dǎo)分化后形成成熟肝細(xì)胞特征性的多邊形，方形等形態(tài)。免疫熒光染色顯示在分化成熟21天后可見肝細(xì)胞特異性蛋白ALB在誘導(dǎo)分

6、化來源肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)陽性表達(dá)。BMSC在體外膠原蛋白三維培養(yǎng)誘導(dǎo)分化體系后細(xì)胞同樣具有成熟肝細(xì)胞的形態(tài)。HE染色結(jié)果顯示細(xì)胞在三維培養(yǎng)體系內(nèi)呈多層排列生長，形成細(xì)胞間緊密連接及管狀結(jié)構(gòu)。免疫組化染色結(jié)果顯示BMSC誘導(dǎo)分化來源肝細(xì)胞可表達(dá)特異性蛋白ALB和AFP。
　　 二．BMSC在平面培養(yǎng)誘導(dǎo)作用下可特異的表達(dá)肝細(xì)胞極化蛋白BSEP和SRBI，但未能形成明確的特征性極化結(jié)構(gòu)及膽管結(jié)構(gòu)。BMSC在體外膠原蛋白三維培養(yǎng)誘導(dǎo)分化體系

7、下不僅可特異表達(dá)肝細(xì)胞極化蛋白BSEP和SRBI，且在三維結(jié)構(gòu)中可見相鄰細(xì)胞形成緊密連接，從而形成特征性的極化結(jié)構(gòu)和膽管結(jié)構(gòu)。SRBI定位分布于面向毛細(xì)血管的基底膜面，而BSEP主要分布于面向毛細(xì)膽管的頂膜，相互連接形成特征性的毛細(xì)膽管結(jié)構(gòu)，于小鼠肝原代細(xì)胞類似。
　　 研究結(jié)論：
　　 一．通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)，體外三維培養(yǎng)誘導(dǎo)分化體系作用下BMSC可分化為成熟肝細(xì)胞，細(xì)胞在三維結(jié)構(gòu)內(nèi)早期即形成多層整齊排列，易形成球狀