新型人上皮性卵巢癌細(xì)胞HO8910靶向治療系統(tǒng)的構(gòu)建及其生物學(xué)活性的體外研究.pdf

1、研究背景：目前，卵巢癌仍是致死率最高的婦科惡性腫瘤，5年生存率低于30％。臨床上一線治療卵巢癌的“金標(biāo)準(zhǔn)”是滿意的初次腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)后給予紫杉醇+卡鉑方案聯(lián)合化療，盡管初次化療反應(yīng)良好，但絕大多數(shù)患者易復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)性卵巢癌大多數(shù)容易耐藥。卵巢癌患者的生存現(xiàn)狀十分嚴(yán)峻，探索手術(shù)、化療、放療之外新的治療方法顯得尤為重要。目前卵巢癌的生物靶向治療已取得不少研究成果，但臨床應(yīng)用效果仍不理想，分子靶向藥物治療的靶向性差仍是需解決的問題。
　

2、　細(xì)胞穿膜肽(CPPs)聯(lián)合靶向治療將為腫瘤的治療開辟新途徑。轉(zhuǎn)錄反式激活因子(TAT)是一種高效的 CPPs，可攜帶大分子物質(zhì)進(jìn)人細(xì)胞并保證其生物活性。P38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)及凋亡過程中發(fā)揮重要作用。MKK6(E)是MKK6的活性突變體，它通過自發(fā)的激活P38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而介導(dǎo)凋亡。本課題組前期研究已采用全細(xì)胞差減法篩選出卵巢癌上皮細(xì)胞H08910特異性結(jié)合的7個(gè)氨基酸短肽SWQIGGN，命名為OSBP。本研

3、究擬將TAT攜帶小分子靶向肽及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的MKK6(E)，構(gòu)建腫瘤藥物分子靶向殺滅系統(tǒng)，在卵巢癌治療方面國(guó)內(nèi)外尚未有報(bào)道。
　　目的：本研究擬將TAT與H08910細(xì)胞株特異性結(jié)合短肽OSBP聯(lián)合，結(jié)合誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的MKK6(E)，構(gòu)建TAT-OSBP-MKK6(E)原核表達(dá)載體，獲得可溶性融合蛋白，并對(duì)其靶向輸送特性和體外活性進(jìn)行研究鑒定，探索一種新型的腫瘤靶向穿膜藥物治療系統(tǒng)，為卵巢癌的有效治療提供新的可能。

4、　　方法：采用PGEX-6P-3質(zhì)粒分別構(gòu)建TAT-EGFP，OSBP-EGFP,TAT-OSBP-EGFP,TAT-OSBP和TAT-OSBP-MKK6(E)表達(dá)載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3)大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和GST SefinoseTMResin柱親和層析純化后，采用SDS-PAGE和Western blotting鑒定。流式細(xì)胞術(shù)分析不同濃度(0,1,5,10umol/L) TAT-EGFP,OSBP-EGFP和

5、TAT-OSBP-EGFP融合蛋白處理H08910細(xì)胞2h后的細(xì)胞穿膜率，細(xì)胞免疫熒光法及流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)三種融合蛋白對(duì)H08910的輸送特性，CCK-8法檢測(cè)0,1,5,10,15,40,60,80,100umol/L TAT-OSBP-EGFP處理H08910細(xì)胞2h后的細(xì)胞活性。通過細(xì)胞增殖及凋亡實(shí)驗(yàn)了解融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果。
　　結(jié)果：
　　1.成功的構(gòu)建TAT-EGFP，O

6、SBP-EGFP,TAT-OSBP-EGFP,TAT-OSBP-MKK6(E)和TAT-OSBP原核表達(dá)載體，并獲得各自相應(yīng)的可溶性融合蛋白。
　　2.與 TAT-EGFP相比，當(dāng)濃度為10umol/L時(shí)，TAT-OSBP-EGFP處理后H08910細(xì)胞的穿膜率無明顯升高;但當(dāng)濃度1,5umol/L時(shí)，TAT-OSBP-EGFP處理后H08910細(xì)胞的穿膜率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng) TAT-OSBP-EGFP蛋白處理，H0891

7、0細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度高于對(duì)照組細(xì)胞;經(jīng)TAT-EGFP蛋白處理，H08910細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度與對(duì)照組細(xì)胞相似;經(jīng)OSBP-EGFP蛋白處理，兩種細(xì)胞內(nèi)未見明顯的綠色熒光。不同濃度TAT-OSBP-EGEP對(duì)H08910細(xì)胞活性無影響。
　　3.體外實(shí)驗(yàn)中，融合蛋白TAT-OSBP-MKK6（E）對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制效應(yīng)，不同的細(xì)胞其抑制生長(zhǎng)的程度有差別，對(duì)HO8910細(xì)胞株的抑制作用最大；TAT-OSBP-MKK6（E）可以選擇性

8、的介導(dǎo)卵巢癌 HO8910細(xì)胞株的凋亡；TAT-OSBP-MKK6(E)、TAT-MKK6(E)均不能介導(dǎo)正常卵巢上皮細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論：
　　1.TAT-OSBP-EGFP綜合了TAT-EGFP、OSBP-EGFP兩組蛋白各自的廣泛穿膜和靶向定位的功能特點(diǎn)，具有最佳的優(yōu)勢(shì)。
　　2.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度的TAT-OSBP-EGFP對(duì)H08910細(xì)胞活性無影響，表明TAT-OSBP-EGFP是一種較為