操作液中不同添加物對豬ICSI影響及相關(guān)問題研究.pdf

1、單精子胞質(zhì)內(nèi)顯微注射(ICSI)技術(shù)能夠提高配子利用率，獲取所需性別動物，解決雄性動物少精不孕問題，作為輔助技術(shù)在轉(zhuǎn)基因工程研究領(lǐng)域具有重大作用。在實施ICSI操作過程中，通常在操作液中添加PVP(聚乙烯吡咯烷酮——一種高分子物質(zhì))來降低精子運動性，減少注射針與精子的粘連，便于操作。但是，PVP同精子一起注入到胞質(zhì)內(nèi)會包圍在精子周圍，不但使精子質(zhì)膜變得堅韌影響破裂，影響精核解聚，而且阻礙精子向胞質(zhì)釋放使卵母細胞激活的精子蛋白，影響卵母細

2、胞的活化，使ICSI的成功率受到嚴重影響；但是，不添加PVP由于粘連會明顯增加顯微操作難度。 本試驗針對ICSI技術(shù)存在的注射針粘連、卵膜柔韌程度、PVP物質(zhì)包繞精子、精子解聚困難和卵母細胞活化不足等問題，通過研究ICSI操作液中防粘連物質(zhì)的使用和選擇可以替代PVP的新的生理性防粘連物質(zhì)，減少PVP所產(chǎn)生的不良影響，探索克服和解決這些ICSI技術(shù)問題的方法，提高豬ICSI效果。 本試驗?zāi)康氖茄芯孔鳛镻VP替代物質(zhì)的HA(

3、透明質(zhì)酸)，配合在操作液中使用CB(細胞松馳素B)，進行豬ICSI操作的基本程序，通過減少傳統(tǒng)的在操作液中使用PVP存在的不良作用，提高豬ICSI胚胎發(fā)育率。試驗首先通過傳統(tǒng)的方法，在操作液中添加PVP進行ICSI操作，研究精子解聚和原核形成的時間；進而研究ICSI后卵母細胞的電、化學激活方法；操作液中添加CB的輔助作用；在固定電、化學激活參數(shù)和原核觀察時間的基礎(chǔ)上，試驗選擇和PVP有類似潤滑作用的生理性物質(zhì)HA，分別對PVP和HA的適

4、宜操作濃度進行了研究；最后以卵裂率、8-細胞以上胚胎發(fā)育率為指標比較在最適PVP和HA濃度下兩種防粘連物質(zhì)對豬ICSI效果的影響。研究結(jié)果如下： 試驗一：豬ICSI后精子解聚和原核形成時間觀察。采用豬精子進行ICSI，分別于注射后7h、10h、13h、16h和19h通過熒光染色觀察精核解聚和原核形成情況。ICSI后7小時僅有5.2％的精子解聚，并未見到雌雄原核的形成。ICSI后10h，12.5％精子進入解聚狀態(tài)；ICSI后13h

5、，處于精核解聚狀態(tài)的精子所占比率增至29.0％，有6.5％精子已經(jīng)形成雄原核；ICSI后16h，16.7％精子處于解聚狀態(tài)，雄原核形成率迅速增至28.8％；ICSI后19h，12.5％精子處于解聚狀態(tài)，41.7％精子形成雄原核。結(jié)果表明精核解聚主要發(fā)生在ICSI后13h-16h，雄原核形成率隨著時間延長而增。這為后面試驗觀察解聚精子和原核形成提供了時間依據(jù)，觀察精核解聚和原核形成的時間為ICSI后16h為宜。 試驗二：不同激活方

6、法對豬ICSI效果的影響。在本試驗中，針對卵母細胞ICSI后活化不足的問題，在ICSI后進行一般性電激活(場強0.4KV/cm、脈沖時程90μs、一次脈沖)的基礎(chǔ)上，之后分為三組，對照組在電激活清洗后直接放胚胎液中培養(yǎng)；其他兩組分別在電激活后用2mmol/L6-DMAP、10ug/mlCHX處理6h，進行化學補充激活，清洗后放入胚胎液中培養(yǎng)。結(jié)果表明，對照組卵裂率低于6-DMAP組和CHX組，與6-DMAP組差異極顯著(41.0％vs4

7、4.3％)(p＜0.01)，與CHX組差異顯著(41.0％vs43.5％)(p＜0.05)。對照組8-細胞以上胚胎數(shù)低于6-DMAP組和CHX組，與6-DMAP組差異極顯著(14.1％vs19.0％)(p＜0.01)，與CHX組差異顯著(14.1％vs17.6％)(p＜0.05)。6-DMAP組和CHX組之間卵裂率和8-細胞以上胚胎數(shù)無顯著差異(p＞0.05)。上述結(jié)果說明：豬體外成熟卵母細胞ICSI后僅依靠電激活不足以使MII期中期的

8、卵母細胞活化，采用電激活+6-DMAP(或CHX)激活，能夠有效活化卵母細胞，降低MPF分子作用，從而提高ICSI胚胎的發(fā)育效果，后面試驗均采用6-DMAP進行化學補充激活。 試驗三：操作液中添加CB對ICSI效果的影響。本試驗針對注射精子時卵膜的脆弱易損問題，比較在操作液中添加CB與對照組(不添加CB)的試驗效果。試驗組卵裂率高于未加CB組的對照組(46.7％vs43.7％)，差異顯著(p＜0.05)，試驗組8-細胞以上胚胎數(shù)

9、高于對照組(18.7％vs18.3％)，差異不顯著(p＞0.05)，說明注射卵母細胞的操作液中添加CB不但能夠使操作容易進行，而且還可以改善豬ICSI受精卵的卵裂效果。 試驗四：操作液中添加不同濃度PVP對ICSI效果的影響。試驗選擇5％和10％兩組PVP濃度進行試驗，結(jié)果表明兩組解聚精子數(shù)無顯著差異(16.5％vs16.8％)(p＞0.05)，5％PVP組雄原核形成數(shù)高于10％PVP組(28.7％vs23.7％)，差異顯著(p

10、＜0.05)，5％PVP組卵裂率高于10％PVP組，差異顯著(46.7％vs42.2％)(p＜0.05)，5％PVP組8-細胞以上胚胎數(shù)略高于10％PVP組，差異不顯著(18.7％vs17.6％)(p＞0.05)。結(jié)果說明降低PVP濃度有利于雄原核形成，能夠提高豬ICSI卵的卵裂率。 試驗五：操作液中添加不同濃度HA對ICSI效果的影響。試驗選擇在操作液中添加0.5mg/ml、1.Smg/ml和2.5mg/ml三組HA濃度進行試

11、驗，結(jié)果表明三組解聚精子數(shù)(16.0％Vs15.7％，16.2％)和雄原核形成數(shù)(30.2％vs30.4％，29.3％)無顯著差異(p＞0.05)。0.5mg/mlHA組卵裂率低于其他兩組，差異極顯著(46.0％vs50.1％，49.6％)(p＜0.01)，1.5mg/mlHA組與2.5mg/mlHA組卵裂率(50.1％vs49.6％)和8-細胞以上胚胎數(shù)(22.4％vs21.2％)差異不顯著(p＞0.05)，0.5mg/mlHA組8-

12、細胞以上胚胎數(shù)最低。操作液中添加1.5mg/mlHA更有利于注射卵的發(fā)育。 1.5mg/mlHA組和5％PVP組相比較，操作過程中潤滑作用相似，兩組解聚精子比率之間無顯著差異(p＞0.05)；HA組雄原核形成率、卵裂率、8-細胞以上胚胎數(shù)都顯著高于PVP組(30.4％vs28.7％)(50.1％vs46.7％)(22.4％vs18.75％)(p＜0.05)。結(jié)果表明，操作液中用1.5mg/mlHA代替5％PVP更有利于注射卵的發(fā)

13、育。 結(jié)論：豬ICSI操作過程中，操作液中添加CB，并且用1.5mg/mlHA代替5％PVP，電激活后再用6-DMAP處理6h對卵母細胞進行化學補充激活能夠明顯改善豬ICSI胚胎的發(fā)育效果。與傳統(tǒng)的在豬ICSI操作液中添加PVP的方法相比，從精子解聚、原核形成、卵裂率、8-細胞以上胚胎數(shù)等多方面統(tǒng)計結(jié)果可以看出，所選擇的HA不但能夠像PVP一樣增加潤滑程度、減少精子對注射針的粘附，而且還使精、卵之間的互作加強，豬ICSI效果明顯