缺血后心肌胰島素抵抗促發(fā)缺血性心力衰竭及其機制.pdf

1、研究背景：
　　心力衰竭（心衰）與胰島素抵抗之間存在密切的關(guān)系。一方面，胰島素抵抗是心衰發(fā)生的獨立危險因素；另一方面，心衰患者也較普遍存在胰島素抵抗，且有胰島素抵抗的心衰患者預(yù)后更差。然而，以往的這些研究主要關(guān)注的是全身胰島素抵抗（systemic insulin resistance）與心衰的關(guān)系。我們和其他課題組近年均發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗有器官特異性。心肌也是胰島素作用的靶器官之一，但由于心肌只占到機體體重的0.5％，對整體血糖水

2、平的影響不大，長期以來對心肌胰島素敏感性問題亦未引起足夠的重視。我們課題組的前期研究提示，心肌胰島素抵抗（myocardial insulin resistance）與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有著直接的關(guān)系，但心肌胰島素抵抗在心衰過程中所起的作用及其機制目前尚不清楚。
　　研究目的：
　　1.明確心肌梗死后心肌胰島素敏感性是否發(fā)生變化，心肌缺血后是否會發(fā)生心肌胰島素抵抗？
　　2.若存在心肌胰島素抵抗，探討其發(fā)生的主要機

3、制及其與缺血后心衰發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。
　　實驗方法：
　　大鼠冠脈左前降支結(jié)扎造缺血性心衰模型。在心梗手術(shù)前和心梗1 wk、2 wk、4 wk和8 wk后，對大鼠行超聲心動圖檢測，檢測心臟結(jié)構(gòu)和收縮功能。測定空腹血糖和血清胰島素水平，行葡萄糖耐量試驗和胰島素耐量試驗評價大鼠全身胰島素敏感性。應(yīng)用小動物PET/CT測定胰島素刺激下心肌對氟脫氧葡萄糖（FDG）的最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值（SUVmax，standardized uptake

4、value）評價心肌胰島素敏感性，Western blot方法分析在不同情況下心肌胰島素信號分子的變化。
　　以酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（ELISA）測定心肌與血清TNF-α的水平。應(yīng)用過表達(dá)TNF-α的腺病毒間接經(jīng)冠脈轉(zhuǎn)染正常大鼠心肌，以表達(dá)GFP的腺病毒作為對照，觀察TNF-α在心肌過表達(dá)能否直接引起心肌胰島素抵抗。另一方面，在心肌缺血前兩天開始給予大鼠腹腔注射TNF-α拮抗劑依那西普（Etanercept）300μg/250 g體

5、重，然后在缺血1 wk內(nèi)每兩天腹腔注射相同劑量依那西普，觀察拮抗TNF-α對心肌胰島素敏感性的影響。參照前期相關(guān)研究，在缺血1 wk內(nèi)給予大鼠胰島素治療，觀察其對心肌胰島素敏感性和心衰進(jìn)程的影響。
　　委托南京大學(xué)模式動物研究所構(gòu)建胰島素受體（Insr）基因基于 Cre-LoxP條件性敲除小鼠Insrfl/fl，與肌球蛋白重鏈α(α-MHC)調(diào)控的他莫昔芬誘導(dǎo)Cre表達(dá)的小鼠（α-MHC-MerCreMer）雜交后得到α-MHC-

6、MerCreMer/Insrfl/fl小鼠。選用8-10周齡的α-MHC-MerCreMer/Insrfl/fl雄性小鼠給予腹腔注射他莫昔芬50 mg/kg，連續(xù)3天，以誘導(dǎo)心肌特異性 Cre的表達(dá)，敲除心肌胰島素受體基因，得到他莫昔芬誘導(dǎo)的心肌特異性胰島素受體敲除小鼠（tamoxifen-induced cardiomyocyte-specific insulin receptor knockout，TCIRKO）。行葡萄糖耐量試驗和

7、胰島素耐量試驗評價小鼠的全身胰島素敏感性。缺血前和缺血4 wk后，對心肌特異性胰島素受體敲除小鼠和對照小鼠用超聲心動圖檢測心臟結(jié)構(gòu)和功能變化。
　　實驗結(jié)果：
　　1.心肌缺血后心功能進(jìn)行性降低，室腔逐漸擴大。手術(shù)前，假手術(shù)（Sham）組和心肌缺血（MI）組的EF、LVESD和LVEDD值無明顯差異。心肌缺血1 wk時，MI組的射血分?jǐn)?shù)（EF）從手術(shù)前的71.6±1.9%下降到53.1±3.4%（P<0.001），左室收縮末

8、期內(nèi)徑（LVESD）從0.22±0.03 cm增加到0.45±0.03 cm（P<0.001），左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）從0.51±0.02 cm增加到0.65±0.03 cm（P<0.001）。在心肌缺血4 wk時，MI組的EF下降到40.1±3.1%，LVESD增加到0.62±0.03 cm，LVEDD增加到0.75±0.03 cm，其中 EF和LVESD與心肌缺血1 wk時相比均有明顯差異（P<0.05和P<0.01）。在心

9、肌缺血8 wk時，MI組的EF值為38.2±4.3%，LVESD與LVEDD分別為0.63±0.03 cm、0.78±0.03 cm，與心肌缺血4 wk時相比無明顯差異。
　　2.心肌缺血1 wk時，心肌發(fā)生胰島素抵抗，而全身胰島素敏感性無明顯變化。與基礎(chǔ)狀態(tài)（未予胰島素刺激）相比，胰島素可明顯增加 Sham組大鼠心肌 FDG攝?。⊿UVmax5.1±0.5 vs.0.9±0.2 g/ml，n=6，P<0.001）。與Sham組大

10、鼠相比，心肌缺血30 min時胰島素刺激下的心肌FDG攝取值更高（SUVmax9.5±0.8 vs.5.1±0.5 g/ml，n=6，P<0.001），但在此之后（缺血1 d到2 wk）胰島素刺激下的心肌FDG攝取逐漸降低。與Sham組相比，心肌缺血1 wk與2 wk時胰島素刺激下的心肌FDG攝取均明顯降低（SUVmax MI1 wk2.7±0.4 vs.5.1±0.5 g/ml；MI2 wk2.1±0.5 vs.5.1±0.5 g/m

11、l，n=6，均P<0.01），而在心肌缺血1 d、1 wk和2 wk時，空腹血糖（FPG）、血清胰島素水平（FIN）、定量胰島素敏感性檢測指數(shù)(Quantitative insulin sensitivity check index，QUICKI)與Sham組相比均無明顯差異，口服葡萄糖耐量試驗和胰島素耐量試驗的結(jié)果也無明顯差異，表明心衰早期有心肌胰島素抵抗的發(fā)生，但并無全身胰島素敏感性的明顯變化。
　　3.心肌缺血1 wk時，心

12、肌的胰島素信號通路出現(xiàn)選擇性轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙。與基礎(chǔ)狀態(tài)相比，胰島素刺激可明顯增加Sham組心肌Akt的磷酸化和GLUT4的膜轉(zhuǎn)位，輕度增加ERK1/2的磷酸化，而對p38 MAPK的磷酸化無明顯影響。在心肌缺血1 d時，胰島素刺激仍可增加心肌Akt和ERK1/2的磷酸化，增加GLUT4的膜轉(zhuǎn)位，減少p38 MAPK的磷酸化。但在心肌缺血1 wk時，與基礎(chǔ)狀態(tài)相比，胰島素刺激增加心肌Akt磷酸化和GLUT4膜轉(zhuǎn)位的效應(yīng)明顯降低，而明顯增加心肌p

13、38 MAPK的磷酸化。上述結(jié)果表明，正常情況下胰島素可激活A(yù)kt和ERK1/2，但在心肌缺血1 wk時，胰島素激活A(yù)kt和ERK1/2受阻，而明顯激活p38 MAPK，即出現(xiàn)胰島素信號通路的選擇性轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙。
　　4.正常心肌過表達(dá)TNF-α直接引起心肌胰島素抵抗。與轉(zhuǎn)染過表達(dá)GFP腺病毒的對照組相比，轉(zhuǎn)染過表達(dá)TNF-α腺病毒的大鼠心肌中TNF-α的水平明顯升高，但血清中的TNF-α未能測出（低于ELISA試劑盒的測定下限10

14、pg/ml）。在GFP腺病毒轉(zhuǎn)染心肌1 wk時，胰島素刺激可明顯增加心肌FDG攝取，Akt磷酸化和GLUT4轉(zhuǎn)位。然而，在TNF-α腺病毒轉(zhuǎn)染心肌1 wk時，胰島素的上述效應(yīng)明顯被抑制，與此同時，TNF-α腺病毒轉(zhuǎn)染心肌的p38 MPAK的磷酸化明顯增加。
　　5.心肌過表達(dá)TNF-α加重缺血后的心臟功能障礙和心室擴張。GFP腺病毒和TNF-α腺病毒轉(zhuǎn)染前大鼠的心臟射血分?jǐn)?shù)與室腔內(nèi)徑無明顯差異。行腺病毒轉(zhuǎn)染的同時，結(jié)扎大鼠冠狀動脈

15、左前降支造心肌缺血模型。在心肌缺血1 wk時，與GFP腺病毒轉(zhuǎn)染心肌相比，TNF-α腺病毒轉(zhuǎn)染的心臟射血分?jǐn)?shù)更低(EF41.3±4.2 vs.55.2±3.4%，n=6，P<0.05)，室腔內(nèi)徑更大(LVESD0.63±0.04 vs.0.52±0.03 cm，n=6，P<0.05)。在缺血4 wk時，GFP腺病毒和TNF-α腺病毒轉(zhuǎn)染大鼠的心臟射血分?jǐn)?shù)與室腔內(nèi)徑無明顯差異。
　　6.給予依那西普降低心肌TNF-α水平，可部分恢復(fù)

16、心肌的胰島素敏感性，但未能改善缺血后心臟的功能和心室重構(gòu)。大鼠心肌缺血1 d和1 wk后心肌TNF-α水平明顯升高，而血清TNF-α水平未能測出，依那西普干預(yù)后心肌TNF-α水平明顯降低。在心肌缺血1 wk時，胰島素刺激下FDG攝取、Akt磷酸化和GLUT4轉(zhuǎn)位均明顯降低，而給予依那西普可部分恢復(fù)了胰島素的上述效應(yīng)，下調(diào) p38 MAPK的磷酸化水平。大鼠缺血4 wk時，生理鹽水處理組大鼠與依那西普處理組大鼠心臟的射血分?jǐn)?shù)與左室收縮末期

17、內(nèi)徑均無明顯差異(EF43.0±2.7% vs.40.1±3.1%，LVESD0.60±0.03 cm vs.0.62±0.03 cm，n=6，P>0.1)。
　　7.缺血早期胰島素干預(yù)可改善缺血后心肌胰島素敏感性和心臟功能，抑制左室擴張。缺血后早期胰島素干預(yù)（心肌缺血30 min后從尾靜脈泵注50 U/L胰島素2.5 h，泵注速率4 ml/kg/h，然后在缺血1 wk內(nèi)每天給大鼠皮下注射胰島素0.5 U/kg BW）可明顯降低缺

18、血1 d和1 wk后非梗死區(qū)心肌的TNF-α含量，改善心肌缺血1 wk時胰島素刺激的FDG攝取。與生理鹽水對照組相比，早期胰島素干預(yù)組的心臟功能（EF，54.3±4.1%vs.40.1±3.1%，n=6，P<0.05）明顯增加，左室收縮末期內(nèi)徑明顯降低（圖6F，LVESD，0.48±0.04 cm vs.0.62±0.03 cm，n=6，P<0.05）。
　　8.心肌特異性胰島素受體敲除加重小鼠缺血后心臟功能障礙和室腔擴張。Wes

19、tern blot的結(jié)果顯示，TCIRKO小鼠表現(xiàn)為心肌特異性的胰島素受體敲除（骨骼肌和肝臟的胰島素受體表達(dá)正常）?；A(chǔ)狀態(tài)下，TCIRKO小鼠與對照小鼠心臟的心臟功能和室腔內(nèi)徑相比無明顯差異，但在心肌缺血4 wk后，與對照小鼠相比，TCIRKO小鼠的射血分?jǐn)?shù)更低（EF31.5±2.4%vs.45.2±2.7%，n=6，P<0.05），左室收縮末期容積更大（LVESV56.0±5.3μl vs.35.4±3.5μl，n=6，P<0.05