電刺激迷走神經(jīng)治療慢性缺血性心力衰竭中miRNAs及其信號(hào)通路的研究.pdf

1、目的：
　　慢性心力衰竭是所有心臟疾病發(fā)展的終末階段，該疾病對(duì)我國人民的健康和生活質(zhì)量產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響。在慢性心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展中存在著交感神經(jīng)的過度激活和迷走神經(jīng)活性的減弱。目前臨床對(duì)于缺血性心衰的治療旨在抑制交感神經(jīng)活性，而對(duì)提高迷走神經(jīng)活性的治療方案尚無明確的臨床指南。對(duì)于迷走神經(jīng)功能在心衰發(fā)展中的調(diào)控機(jī)制并不明確，如何通過提高迷走神經(jīng)活性改善心衰預(yù)后是近年來的研究熱點(diǎn)。本研究預(yù)通過建立大鼠的慢性心力衰竭模型，而后給予其電

2、刺激迷走神經(jīng)的治療措施，并通過應(yīng)用miRNA差異表達(dá)篩選的途徑探尋迷走神經(jīng)活性在心衰發(fā)生及治療中的機(jī)制。
　　方法：
　　一、心肌梗死后大鼠慢性心力衰竭動(dòng)物模型的建立
　　健康的雄性Wistar大鼠，采用開胸結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支的方法使大鼠發(fā)生致心肌梗死。另外，設(shè)立對(duì)照組。在入組時(shí)和結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支所致心肌梗死8周后檢測(cè)大鼠血清腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)和超聲心動(dòng)圖

3、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)、左心室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume，LVEDV)、左心室收縮末期容積(left ventricular end systolic volume，LVESV)等指標(biāo)。于結(jié)扎大鼠

4、左冠狀動(dòng)脈前降支所致心肌梗死8周后，光學(xué)顯微鏡觀察HE染色和Masson染色下心肌細(xì)胞形態(tài)。
　　二、電刺激迷走神經(jīng)治療大鼠慢性缺血性心力衰竭的臨床療效的研究
　　經(jīng)超聲及血清學(xué)判定為慢性缺血性心力衰竭的大鼠16只，隨機(jī)分配入心衰組和刺激組。心衰組（慢性心力衰竭大鼠僅暴露頸部迷走神經(jīng)），刺激組（慢性心力衰竭大鼠給予72小時(shí)迷走神經(jīng)刺激）。分別于入組時(shí)和迷走神經(jīng)刺激72小時(shí)后檢測(cè)大鼠血清BNP和超聲心動(dòng)圖LVEF、LVFS、L

5、VEDV、LVESV等指標(biāo)。
　　三、電刺激迷走神經(jīng)治療大鼠慢性缺血性心力衰竭機(jī)制的研究
　　隨機(jī)選取對(duì)照組、心衰組和刺激組的心肌梗死邊緣區(qū)的標(biāo)本進(jìn)行miRNA微陣列分析以篩選三組中均存在差異性表達(dá)的miRANs。
　　通過搜索miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫，得到差異表達(dá)的microRNA調(diào)控的所有靶基因。對(duì)所有功能及通路，利用卡方檢驗(yàn)，計(jì)算其的顯著性水平，篩選出靶基因參與的顯著性功能和通路。
　　結(jié)果：
　　1、

6、心肌梗死后大鼠心力衰竭動(dòng)物模型的建立。成功建立心肌梗死后慢性缺血性心力衰竭模型大鼠16只。冠狀動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)8周后，心力衰竭組大鼠BNP水平明顯高于對(duì)照組，心力衰竭組大鼠LVEF、LVFS較對(duì)照組水平明顯下降，LVEDV、LVEVS較對(duì)照組水平明顯增加。
　　2、全部心衰組及對(duì)照組動(dòng)物于手術(shù)后8周行經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。在心肌梗死后8周時(shí)，心衰組BNP為127.3±19.4mmol/L，刺激組為131.1±19.8mmol/L，兩組間

7、比較無明顯差異(p=0.655)。而經(jīng)過72小時(shí)后，心衰組BNP為134.0±14.8mmol/L，刺激組為112.1±21.0mmol/L。刺激組較心衰組明顯減低，其中p＜0.05(p=0.041)。
　　在心肌梗死術(shù)后8周時(shí)，心衰組和刺激組兩組EF值分別為44.9±4.7％和45.4±2.4％（組間無明顯差異，P=0.78）。而經(jīng)電刺激治療后刺激組的EF明顯改善，升高為53.2±7.7％，（組內(nèi)比較刺激前后配對(duì)樣本的T檢驗(yàn)，p

8、=0.017，p＜0.05）。而心衰組經(jīng)過72小時(shí)后EF值為42.7±4.6％(心衰組內(nèi)兩時(shí)間點(diǎn)對(duì)比無顯著差異，P=0.22)。在72小時(shí)后這一時(shí)間點(diǎn)比較心衰組及刺激組兩組的EF值，刺激組較心衰組明顯改善，其中p＜0.05。
　　3、為探討電刺激迷走神經(jīng)改善慢性缺血性心力衰竭這一過程潛在的信號(hào)通路和分子機(jī)制，我們選取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)照組為左心室，心衰組及刺激組為心肌梗死邊緣區(qū)部位心肌組織利用miRCURY LNA芯片技術(shù)篩選，首先篩選出

9、在對(duì)照組及心衰組中差異表達(dá)的miRNA表達(dá)譜。篩選標(biāo)準(zhǔn)為變化倍數(shù)≥1.5或0.67，且p值＜0.05。在心力衰竭大鼠和正常大鼠比較中，共有41個(gè)miRNAs存在差異性表達(dá)，而經(jīng)迷走神經(jīng)刺激治療后，即迷走神經(jīng)刺激組同心衰組比較中，共有47個(gè)miRNAs的表達(dá)發(fā)生明顯變化。中和三組比較，在心衰后及迷走神經(jīng)刺激后均發(fā)生顯著變化的miRNAs共有11個(gè)，其中在心衰后表達(dá)上調(diào)，而在刺激后表達(dá)下調(diào)的分別為miR-205、miR-540-3p和miR

10、-495，在心衰后表達(dá)下調(diào)而在刺激后表達(dá)下調(diào)的為miR-103-3p、miR-150-5p、miR-350、miR-138-1-3p、miR-3571、miR-129-1-3p、miR-133a-3p、miR-133b-3p共8個(gè)miRNAs。
　　對(duì)于差異性表達(dá)的miRNAs及其靶基進(jìn)行GO及KEGG富集分析是發(fā)現(xiàn)，這一過程中可能參與的通路有尼古丁成癮相關(guān)通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用信號(hào)通路、以及過氧化物酶體信號(hào)通路和擴(kuò)張型心肌

11、病信號(hào)通路等。
　　在差異性表達(dá)的miRNAs中，選取3個(gè)miRNA進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證。
　　結(jié)果顯示3個(gè)miRNAs的差異表達(dá)趨勢(shì)同芯片結(jié)果一致，同時(shí)均具有顯著差異P＜0.05。
　　結(jié)論：
　　1、通過結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支，從而造成大鼠的心肌梗死方法可以建立穩(wěn)定的大鼠慢性心力衰竭動(dòng)物模型。血清腦鈉肽測(cè)定與超聲心動(dòng)圖測(cè)定心梗面積及LVEF等左室功能指標(biāo)可以作為活體大鼠診斷心肌梗死后心力衰竭的標(biāo)準(zhǔn)，與大鼠處死