Aurora-A激酶通過Akt下調(diào)IkappaBα促進腫瘤細胞生存的信號傳導通路研究.pdf

1、Aurora激酶是近年來研究較熱的一個有絲分裂蛋白激酶，它為進化上保守的絲/蘇氨酸激酶，參與了中心體的成熟、分離；紡錘體的組裝、穩(wěn)定；染色體的濃集、中板聚合和穩(wěn)定等多種事件。人類細胞中有3種高度相關(guān)的Aurora激酶(A、B和C)，其中Aurora A(Aur-A)激酶異常表達往往導致細胞轉(zhuǎn)化，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目前已發(fā)現(xiàn)Aur-A在多種實體腫瘤和血液腫瘤中高表達，但其在舌癌中的表達未有報道。Aurora激酶的小分子抑制劑

2、VX-680以其選擇性強、毒力低的優(yōu)勢已試用丁非小細胞肺癌、大腸癌的臨床治療，顯示出此新靶點的優(yōu)越療效。并且，VX-680對Aur-A具有更特異的阻斷性(Ki=0.6，Aur-B為18，Aur-C為4.6nM)。VX-680能夠通過阻止腫瘤細胞正常分裂并誘導腫瘤細胞凋亡從而對腫瘤細胞產(chǎn)生長效抗癌作用。但足Aur-A促進腫瘤細胞生存、抑制細胞凋亡的信號傳導通路目前仍不清楚。為此，本研究做了如下探討：
　　 1.Aur-A激酶在TS

3、CC中的表達
　　 收集了初治的55例舌鱗癌根治術(shù)的手術(shù)標本及30例陰性切緣組織作為對照。用免疫組織化學染色的方法檢測了Aur-A蛋白的表達情況，并統(tǒng)計分析了Aur-A蛋白表達與TSCC臨床參數(shù)如分期、性別、分化程度等。
　　 本實驗旨在通過觀察Aur-A激酶蛋白在TSCC中的表達情況，分析舌癌患者臨床各指標間的關(guān)系，為其作為TSCC治療的新靶點提供理論依據(jù)。
　　 2.VX-680抑制TSCC細胞生長并誘導其凋

4、亡的研究
　　 將Aur-A小分子抑制劑VX-680作用于TSCC細胞株，首先利用免疫細胞熒光染色的方法觀察VX-680對紡錘體形成及Histone H3(Serl0)的表達水平的影響，以明確VX-680對Aur-A激酶活性的抑制作用。以此為基礎，利用MTT法觀察VX-680對TSCC細胞的生長抑制作用；利用Annexin V/PI免疫熒光染色及Westemblot檢測凋亡情況。
　　 本實驗嘗試將Aur-A激酶小分子抑

5、制劑VX-680作用于TSCC細胞，觀察其對細胞增殖及誘導凋亡的影響，以明確該小分子抑制劑靶向治療TSCC的作用。
　　 3.Aurora-A激酶與P13K/A kt通路交聯(lián)調(diào)節(jié)VX-680誘導Tca8113細胞凋亡的研究
　　 將VX-680與P13K的激活劑IGF-1或其抑制劑wortmannin單獨、兩兩或三者聯(lián)合用藥處理細胞，利用流式細胞術(shù)及Western blot檢測磷酸化Akt及其下游靶點磷酸化GSK3(Se

6、r21/9)和IKBa蛋白表達、凋亡標志蛋白如Caspase-3及PARP斷裂帶以探討Aur-A激酶與PI3 K/Akt通路的交聯(lián)關(guān)系。
　　 本實驗旨在探討Aur-A與P13K之間的交匯關(guān)系對TSCC細胞凋亡的影響及其機制，為同時靶向Aur-A和PI3K的聯(lián)合用藥提供實驗依據(jù)。
　　 4.Au rora-A激酶與P13K/A kt通路交聯(lián)調(diào)節(jié)舌癌細胞遷移的研究
　　 將VX-680與PI3K的激活劑IGF-1或

7、其抑制劑wortmannin單獨、兩兩或三者聯(lián)合用藥處理細胞，利用Transwell侵襲實驗檢測對TSCC細胞侵襲的影響。
　　 本實驗旨在探討Aur-A與P13K之間的交匯關(guān)系對TSCC細胞遷移的影響，為同時靶向Aur-A和P13K的聯(lián)合用藥提供進一步依據(jù)。
　　 5.Akt在VX-680誘導TSCC細胞凋亡中的作用研究
　　 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Myr-A kt1和空質(zhì)粒pUSE的細胞株，首先用Western blo

8、t確認了轉(zhuǎn)染效率。用VX-680處理轉(zhuǎn)染Myr-Aktl和pUSE的細胞，利用MTT檢測轉(zhuǎn)染Myr-Aktl細胞對VX-680誘導凋亡的影響。
　　 本實驗旨在探討Akt在VX-680誘導TSCC細胞凋亡中所起的作用，探索Akt在Aur-A促進腫瘤細胞生存的信號傳導通路中的上下游關(guān)系。
　　 6.Aur-A激酶調(diào)控Akt及其下游促進腫瘤細胞生存的信號傳導通路
　　 瞬時轉(zhuǎn)染Aur-A，干擾Aur-A或VX-680

9、處理細胞，利用Westem blot檢測磷酸化Akt及其下游IKBa蛋白表達，同時檢測NF-KB的靶基因Bcl-xL蛋白表達；利用免疫細胞熒光染色的方法檢測NF-KB亞基P65在胞核和胞漿的表達情況。更為重要的足，用wortmannin阻斷PI3K，或者用API-2或干擾阻斷Akt后，利用Western blot檢測Aur-A對檢測磷酸化Akt及其下游分子表達的調(diào)控。
　　 本實驗旨在探討Aur-A調(diào)控腫瘤細胞生存的信號傳達通路

10、。
　　 本研究研究的結(jié)果及意義總結(jié)如下：
　　 1.首次明確了Aur-A激酶蛋白在初治的接受舌鱗癌根治術(shù)的患者中的表達，不僅揭示了Aur-A激酶作為一種新的舌癌標志物可能與舌癌的發(fā)生及預后密切相關(guān)，也為其作為分子靶向治療的新靶點提供了理論依據(jù)。
　　 2.明確了Aur-A激酶小分子抑制劑VX-680能夠劑量及時間依賴性的抑制TSCC細胞生長和遷移并誘導細胞凋亡，顯示出了其對TSCC細胞產(chǎn)生的強大的細胞毒作用；更

11、為重要的是，VX-680與PI3K的小分子抑制劑wortmannin聯(lián)合誘導TSCC細胞凋亡具有協(xié)同效應。因此，VX-680作為新的分子靶向藥物以其特異性高，效果顯著，毒性低顯示出其在治療舌癌中的光明前景。
　　 3.闡明了VX-680誘導TSCC細胞凋亡的分子機制，包括：紡錘體單極化、HistoneH3(Ser10)的活性下降、Akt及其下游分子活性下降、PARP剪切、Caspase通路的激活以及下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達