Aurora-A通過異常調(diào)節(jié)DNA損傷應(yīng)答促進腫瘤放化療抵抗.pdf

1、研究背景:
　　腫瘤細胞放化療抵抗?？蓪е履[瘤預(yù)后不良。Aurora-A激酶(Aurora-A)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，與有絲分裂的紡錘體分離，中心體復制相關(guān)，且在多種腫瘤中均高表達，是一種重要的癌基因。近期研究表明Aurora-A可促進腫瘤放化療抵抗，由于Aurora-A與p53，BRCA1，BRCA2等多種DNA損傷應(yīng)答蛋白有著相互作用，因此我們推測Aurora-A很可能通過調(diào)節(jié)DNA損傷應(yīng)答促進腫瘤放化療抵抗。
　　

2、研究目的:
　　研究Aurora-A與DNA損傷應(yīng)答的關(guān)系，揭示Aurora-A促進腫瘤放化療抵抗的機理，探尋Aurora-A相關(guān)腫瘤的新型靶向藥物分子，以期達到腫瘤治療的最佳效果。
　　材料和方法:
　　第一部分.觀察Aurora-A對細胞增殖的影響。
　　1).在乳腺癌、胰腺癌和卵巢癌細胞中選擇Aurora-A低表達的細胞系(MCF-7，PANC-1和OVCA420)，和Aurora-A高表達的細胞系(MDA

3、-MB-231，BXPC3和OVCA429)，通過反轉(zhuǎn)錄病毒法轉(zhuǎn)入或沉默Aurora-A。
　　2).通過細胞計數(shù)和軟瓊脂克隆形成試驗分別繪制細胞生長曲線和克隆形成率柱狀圖。
　　3)用流式細胞術(shù)檢測細胞周期進展。
　　第二部分.檢測Aurora-A對腫瘤放化療抵抗的影響。
　　1).用放射線，順鉑或者Aurora-A抑制劑VX680處理細胞后，通過流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平。
　　2).用MTT檢測順鉑處

4、理后的細胞活力，并計算細胞半數(shù)抑制濃度(IC50)。
　　第三部分.探究Aurora-A引起腫瘤放化療抵抗的機理
　　第一章.檢測Aurora-A與DNA損傷應(yīng)答的關(guān)聯(lián)
　　1).免疫熒光檢測Aurora-A與γ H2AX的關(guān)聯(lián)。
　　2).免疫印跡檢測Aurora-A對DNA損傷應(yīng)答蛋白(ATM， Chk2，ATR，Chk1，RAD51,H2AX,γ2AX,ERCC2,p53,pp53,AKT1,AKT2)的影

5、響。
　　第二章.檢測ATM抑制劑對腫瘤放化療抵抗和DNA損傷應(yīng)答的影響。
　　1).用ATM抑制劑KU-55933處理細胞，然后用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平。
　　2).用免疫印跡檢測ATM抑制劑對DNA損傷應(yīng)答蛋白(pp53，Chk2，γH2AX，RAD51等)的影響。
　　第三章.檢測BRCA1/2與Aurora-A之間的關(guān)系，并研究BRCA1/2對腫瘤放化療抵抗的影響以及與DNA損傷應(yīng)答之間的關(guān)聯(lián)。

6、>　　1).在乳腺癌，胰腺癌和卵巢癌細胞中選擇Aurora-A低表達的細胞系(MCF-7，PANC-1和OVCA420)，以及Aurora-A高表達的細胞系(MDA-MB-231，BXPC3和OVCA429)，通過反轉(zhuǎn)錄病毒法或Fugene6轉(zhuǎn)染試劑使細胞沉默或者過量表達BRCA1/2。
　　2).用免疫印跡檢測BRCA1/2與Aurora-A之間的關(guān)聯(lián)。
　　3).通過細胞計數(shù)和軟瓊脂克隆試驗分別繪制細胞生長曲線和克隆形成

7、率柱狀圖。
　　4).用流式細胞術(shù)檢測細胞周期進展。
　　5).細胞放化療處理后用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平。
　　6).免疫印跡檢測BRCA1/2對DNA損傷應(yīng)答蛋白(p53，pp53，ATM，Chk2，RAD51，γH2AX)的影響。
　　結(jié)果:
　　第一部分
　　Aurora-A可促進細胞增殖，細胞周期進展和軟瓊脂克隆形成，而Aurora-A沉默可抑制細胞增殖，細胞周期進展和克隆形成。
　

8、　第二部分
　　放化療處理后，Aurora-A轉(zhuǎn)入的細胞系凋亡明顯降低，而Aurora-A沉默或者用Aurora-A抑制劑VX680處理的細胞系凋亡明顯增加;順鉑處理后，Aurora-A轉(zhuǎn)入的細胞系IC50增加，而Aurora-A沉默的細胞系IC50降低。
　　第三部分
　　第一章.Aurora-A降低了放射后γH2AX灶點形成，且Aurora-A可異常調(diào)節(jié)DNA損傷應(yīng)答。
　　第二章.ATM抑制劑可增加放化療引

9、起的腫瘤細胞凋亡，并且影響DNA損傷應(yīng)答蛋白表達。
　　第三章.BRCA1/2與Aurora-A負相關(guān)，且BRCA1/2可抑制細胞增殖，體外克隆形成和細胞周期進展，并可通過影響DNA損傷應(yīng)答增加放化療引起的細胞凋亡。
　　結(jié)論:
　　研究發(fā)現(xiàn)，Aurora-A過表達可促進腫瘤細胞增殖，細胞周期進展，軟瓊脂克隆形成，并可直接或者間接通過上調(diào)ATM表達，下調(diào)BRCA1/2表達，調(diào)節(jié)DNA損傷應(yīng)答，促進腫瘤放化療抵抗;相反的