DNA-PK作為放化療增敏靶點的研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：研究DNA雙鏈斷裂修復(fù)蛋白在乳腺癌和乳腺纖維瘤組織中以及宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變中的表達情況，探討3種蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及相互關(guān)系。
　　 方法：應(yīng)用免疫組化SP法檢測55例乳腺癌和14例乳腺纖維瘤組織，以及41例宮頸癌和15例CIN組織中Ku80，。DNA-PKcs和ATM蛋白的表達情況。
　　 結(jié)果：Ku80、DNA-PKcs和ATM蛋白在乳腺癌患者中的陽性率分別為74．55％

2、、54．55％和52．73％，在乳腺纖維瘤患者中的陽性率分別為92．86％、92．86％和71．43％；DNA-PKcs蛋白在乳腺癌組織中的表達顯著低于乳腺纖維瘤組織，而Ku80和ATM的表達雖在乳腺癌組織中的表達亦低于乳腺纖維瘤組織，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。ATM和DNA-PKcs蛋白的表達在不同病理類型、腫塊大小、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的乳腺癌患者中差異無統(tǒng)計學(xué)意義；但Ku80的表達與患者的腫塊大小和臨床分期相關(guān)。Spearman等級

3、相關(guān)分析，在55例乳腺癌患者中，Ku80與DNA-PKcs的表達呈正相關(guān)；K1u80與ATM的表達亦呈正相關(guān)。Ku80、DNA-PKcs和ATM蛋白在宮頸癌患者中的陽性率分別為70．73％、68．29％和19．51％，在CIN患者中的陽性率分別為80．00％、73．33％和33．33％；3種蛋白在宮頸癌組織中的表達均低于CIN組織，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。3種蛋白的表達在不同年齡、病理類型、分化程度和臨床分期的宮頸癌患者中差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

4、SpeaIarian等級相關(guān)分析，在56例患者中，Ku80與DNA-PKcs的表達呈正相關(guān)；Ku80與ATM的表達亦呈正相關(guān)。
　　 結(jié)論：DNA-PKcs和Ku80有可能成為腫瘤治療增敏的靶點；DNA-PKcs蛋白可能在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用；Ku80與DNA-PKcs及ATM之間均存在密切關(guān)系。
　　 第二部分
　　 目的：利用宮頸癌細胞系和正常血管上皮細胞系、正常成纖維細胞系體外模擬宮頸癌實質(zhì)和問質(zhì)血

5、管組織，研究其受到不同劑量放射線照射后的反應(yīng)。
　　 方法：宮頸腺癌細胞系HeLa，宮頸鱗癌細胞系SiHa、C33A、Caski，及人臍靜脈內(nèi)皮細胞系ECV304、小鼠成纖維細胞系NIH/3T3細胞，分別用6MV的x線(300cGy/min)照射6Gy和10Gy，24h和48h后收集細胞碘化丙錠染色，流式細胞術(shù)檢測凋亡率和細胞周期變化。
　　 結(jié)果：受到照射后C33A凋亡率最高，而SiHa最抵抗，其余細胞系介于兩者之間；

6、各宮頸癌細胞系及NIH/3T3照射10Gy后48h產(chǎn)生的凋亡率與6Gy相似(P>O．05)，而ECV304．照射10Gy后48h產(chǎn)生的凋亡率卻比6Gy高許多；各細胞系受到照射后，均表現(xiàn)出明顯的G2/M期阻滯，且G2/M阻滯細胞百分比隨照射劑量增加而增加；受到照射后一般在24h～48h G2/M期阻滯細胞百分比最高。
　　 結(jié)論：高劑量照射提高腫瘤血管的凋亡率，宮頸癌細胞受照射后G2/M期阻滯，且呈劑量依賴性，為高劑量射線治療宮頸

7、癌、追加劑量繼續(xù)放療、選擇周期特異性化療藥物、以及針對G2/M檢測點基因進行靶向阻斷提供了依據(jù)。
　　 第三部分
　　 目的：檢測腫瘤細胞株中DNA雙鏈斷裂修復(fù)蛋白的表達水平和放射敏感性參數(shù)，探討3個蛋白預(yù)示腫瘤細胞放射敏感性的價值。
　　 方法：4株人宮頸癌細胞株HeLa、SiHa、C33A和Caski，3株人乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-453，及1株人肺癌細胞株A549，Wes

8、tern blot檢測8株細胞中Ku80、DNA-PKcs和ATM蛋白的表達水平，流式細胞儀檢測10Gy 6MV X線照射48h后的凋亡率，克隆形成實驗檢測SF2(Surviving fraction after 2Gy)值和α、β值，Pearson線性相關(guān)分析蛋白表達水平與照射后凋亡率、SF2值和α值的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：3種蛋白在同一株細胞中的表達及同一蛋白在不同細胞株的表達均存在明顯差異；DNA-PKcs的表達水平與SF

9、2之間存在正相關(guān)關(guān)系(r=O．72，P=O．04<0．05)；
　　 Ku80和ATM的表達與SF2值問無明顯相關(guān)關(guān)系(P>O．05)；3種蛋白與凋亡率和α值均無相關(guān)性fP>0．05)。
　　 結(jié)論：DNA-PKcs蛋白表達越高細胞對放射線越抵抗，其表達水平可能成為腫瘤細胞放射敏感性的指標(biāo)；DNA-PKcs和Ku80可能可以成為腫瘤放療增敏的理想靶點。
　　 第四部分
　　 目的：建立利用小干擾RNA抑制

10、Ku80表達的HeLa細胞模型，以此探討Ku80在放化療增敏方面的潛在應(yīng)用價值。
　　 方法：構(gòu)建靶向抑制Ku80的siRNA表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HeLa細胞，篩選穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)化克隆，Western blot檢測Ku80表達變化；克隆形成實驗、MTT法和裸鼠皮下瘤形成實驗分別檢測細胞克隆形成率，及細胞在體外和體內(nèi)的增殖情況；6MV X線照射6Gy后，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率和細胞周期，克隆形成實驗檢測細胞SF2、D。等值；MTT檢測細

11、胞受不同濃度托泊替康、依托泊苷和順鉑作用后細胞增殖率變化。
　　 結(jié)果：構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細胞獲得2個穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆，Western blot分析表明陽性克隆Ku80蛋白抑制率達到96．4％，命名為HeLa/Ku80-siRNA；HeLa/Neg-siRNA細胞克隆形成率為0．62±0．02，而HeLa/Ku80一siRNA細胞的克隆形成率為O．46±0．05，明顯低于對照細胞(t=5．11，P<0．01)；MTT顯示細胞培養(yǎng)

12、48h和72h時，HeLa/Ku80-siRNA細胞的增殖率均顯著低于對照細胞(P

13、的細胞周期變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>O．05)；陽性克隆細胞株的Do和SF2值明顯降低，在D10劑量時的增敏比為1．365。Ku80受抑細胞對托泊替康和依托泊苷的敏感性增加(P<0．05)。
　　 結(jié)論：Ku80-siRNA可以抑制Ku80的表達，在體內(nèi)外抑制HeLa細胞的增殖，并促進HeLa細胞對x線和拓撲異構(gòu)酶抑制劑的敏感性。
　　 第五部分
　　 目的：探討DSB修復(fù)蛋白DNA-PKcs成為宮頸癌放療增敏靶點的

14、可能性。
　　 方法：利用靶向抑制DNA-PKcs的小發(fā)卡樣干擾RNA(small hairpin interfering RNA，shRNA)表達質(zhì)粒和小分子抑制劑LY294002，分別抑制HeLa細胞DNA-PKcs蛋白表達和活性后，克隆形成實驗和流式細胞儀檢測HeLa細胞受6MV X線照射后的SF2、α值和凋亡率變化。
　　 結(jié)果：靶向抑制DNA-PKcs的shRNA可以促進宮頸癌HeLa細胞的放射敏感性，其SF2

15、值為O．37，顯著低于對照HeLa細胞的0．53；單獨接受50μmol/L LY294002作用1h未使HeLa細胞的凋亡率明顯增加(P>0．05)，但先經(jīng)LY294002處理再照射6Gy的HeLa細胞在48h和72h的凋亡率比單獨照射6Gy的HeLa細胞凋亡率顯著增加(48h點：t=3．25，P=O．03；72h點：t=3．01，P=O．04)。
　　 結(jié)論：抑制DNA-PKcs的表達或活性可以促進宮頸癌HeLa細胞的放射敏感

16、性；提示DNA-PKcs可能可以成為宮頸癌放療增敏的理想靶點。
　　 第六部分
　　 目的：研究siRNA和LY29400抑制單個或多個DNA雙鏈斷裂修復(fù)蛋白后HeLa細胞放射敏感性和細胞周期的變化。
　　 方法：Ku80受抑細胞HeLa/Ku80-siRNA和對照細胞HeLa/Neg-siRNA分別轉(zhuǎn)染可以靶向抑制抑制DNA-PKcs的siRNA或用PI-3-K抑制劑LY294002處理，經(jīng)6MV X線照射后，

17、克隆形成實驗檢測細胞放射敏感性變化，流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡率變化。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染DNA-PKcs-siRNA后的HeLa/Ku80-siRNA放射敏感性顯著高于HeLa/Ku80-siRNA，SF2分別為O．08±0．01和O．20±0．05，LY294002作用后HeLa/Ku80-siRNA的SF2達到O．03±0．01，作為對照細胞的HeLa/Neg-siRNA其SF2值為O．51±0．07；各細胞照射6Gy后均

18、出現(xiàn)G2/M期阻滯，轉(zhuǎn)染DNA-PKcs-siRNA的HeLa/Neg-siRNA細胞和LY294002作用的HeLa/Ku80-siRNA、HeLa/Neg-siRNA細胞G2/M期阻滯逐漸緩慢出現(xiàn)，照射后72h仍未達到頂點，而其他細胞G2/M期阻滯均于照射后48h達到頂點。
　　 結(jié)論：在抑制Ku80已達95％的基礎(chǔ)上，DSB修復(fù)功能可以由其他DSB修復(fù)蛋白如DNA-PKcs和ATM代償，協(xié)同抑制上述蛋白可以明顯增加HeLa