二烯丙基三硫化物增強(qiáng)HSV-TK-GCV自殺基因系統(tǒng)抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)效應(yīng)的研究.pdf

1、目的：前列腺癌是美國(guó)男性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，死亡率占第二位。近年來(lái)在中國(guó)也逐漸成為威脅男性生命健康的重要問(wèn)題。盡管局部治療包括根治性前列腺切除術(shù)和放療能有效治療早期局部病灶，但大多數(shù)患者在局部治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)。雄激素阻斷治療通常對(duì)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的前列腺癌有效，但其副作用很多，并且這些病人最終會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榧に仉y治性前列腺癌。目前對(duì)激素難治性前列腺癌尚無(wú)有效的治療措施。因此，研究新的、有效的治療方法尤為重要。
　　 近年來(lái)，腫瘤的基因治療已成為

2、研究熱點(diǎn)，其中自殺基因療法是眾多基因治療策略中最有前途的策略之一。單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)/更昔洛韋(GCV)系統(tǒng)是目前自殺基因療法中應(yīng)用最廣泛、最標(biāo)準(zhǔn)的治療方案。HSV-TK基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞后能選擇性磷酸化GCV，后者再由內(nèi)源性細(xì)胞激酶磷酸化轉(zhuǎn)化為三磷酸GCV，三磷酸GCV可直接結(jié)合細(xì)胞DNA，干擾DNA的正常合成，最終導(dǎo)致DNA合成終止和細(xì)胞死亡。自殺基因HSV-TK/GCV系統(tǒng)的另一重要特征是旁觀者效應(yīng)，即CCV除了

3、殺死轉(zhuǎn)染了TK的細(xì)胞，而且也能殺死未轉(zhuǎn)染TK的細(xì)胞。這種效應(yīng)有效擴(kuò)大了自殺基因療法的殺傷作用。自殺基因HSV-TK/GCV系統(tǒng)在多種惡性腫瘤的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，均顯示出有效殺傷作用。多項(xiàng)研究證實(shí)該系統(tǒng)在體外對(duì)鼠或人前列腺癌細(xì)胞有顯著的細(xì)胞毒性作用，在活體內(nèi)顯著抑制前列腺癌的局部生長(zhǎng)以及轉(zhuǎn)移。然而，這種自殺基因療法仍無(wú)法誘導(dǎo)腫瘤的完全消退。眾所周知，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是放療和化療藥物發(fā)揮抗腫瘤效果的機(jī)制之一。有研究表明凋亡在HSV-TK/GCV自殺

4、基因系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞增殖的過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。因此，聯(lián)合其它一些藥物以加速凋亡應(yīng)該是一個(gè)更有前景的方法。
　　 流行病學(xué)研究表明飲食中攝入蔥屬類植物尤其是大蒜，可能減低多種惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，包括前列腺癌。大蒜中的有機(jī)硫復(fù)合物包括二烯丙基一硫化物(DAS)、二烯丙基二硫化物(DADS)、二烯丙基三硫化物(DATS)在防癌效應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。有機(jī)硫復(fù)合物具有很多生物和藥理學(xué)活性，特別是在各種化學(xué)致癌物誘導(dǎo)的動(dòng)物癌癥模

5、型中，可顯現(xiàn)出明顯預(yù)防癌癥的作用。最近研究表明DADS和DATS可通過(guò)誘導(dǎo)凋亡和/或細(xì)胞周期阻滯來(lái)抑制培養(yǎng)的癌細(xì)胞增殖，并且DADS和DATS能顯著誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)；同時(shí)也能顯著抑制裸鼠原位移植瘤的生長(zhǎng)，阻止轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤模型中的腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。研究證明，與DADS相比，DATS具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡、抑制癌細(xì)胞增值能力。那么，DATS聯(lián)合TK/GCV作用于前列腺癌細(xì)胞是否能增強(qiáng)后者的細(xì)胞毒性?如能產(chǎn)生協(xié)同的效果，其

6、機(jī)制是什么?這正是本論文研究的主要問(wèn)題。
　　 本研究用質(zhì)粒tgCMV/HyTK，采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)TK基因的人前列腺癌細(xì)胞株；用GCV聯(lián)合DATS處理細(xì)胞株，測(cè)定不同組間的細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、凋亡相關(guān)蛋白；證實(shí)GCV聯(lián)合DATS抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的協(xié)同效應(yīng)，分析聯(lián)合治療效果的可能機(jī)制，進(jìn)而為前列腺癌的治療提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 ⑴用脂質(zhì)體Lipofectamine200

7、0將質(zhì)粒tgCMV/HyTK轉(zhuǎn)染前列腺癌PC-3細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱PC-3/TK)。潮霉素B篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞并挑選單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。用未轉(zhuǎn)染的PC-3作陰性對(duì)照。RT-PCR鑒定TK基因表達(dá)。
　　 ⑵采用MTT法測(cè)定GCV和DATS處理細(xì)胞后的細(xì)胞增殖能力。用不同濃度的DATS或GCV，培養(yǎng)細(xì)胞24 h，48 h，72 h，用MTT試劑盒檢測(cè)活細(xì)胞，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度A值。計(jì)算各組的細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(％)=用藥組活細(xì)胞A值/對(duì)照

8、組活細(xì)胞A值×100％。以細(xì)胞數(shù)減少50％的藥物濃度確定為DATS和GCV的IC50。為評(píng)價(jià)DATS和GCV的相互作用，用IC50濃度的DATS聯(lián)合不同濃度的GCV處理前列腺癌細(xì)胞48 h后，用MTT法檢測(cè)活細(xì)胞，計(jì)算各組的細(xì)胞存活率。
　　 ⑶采用中效原理分析得出藥物聯(lián)合作用指數(shù)，評(píng)價(jià)DATS和GCV是否有協(xié)同作用。
　　 ⑷各組細(xì)胞被相應(yīng)的藥物處理72h后，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞中sub-G1 DNA的含量；亦用DAP

9、I染色法在熒光顯微鏡下觀察藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，核收縮和破裂的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，未處理細(xì)胞為陰性對(duì)照。
　　 ⑸細(xì)胞被相應(yīng)的藥物處理72 h后，裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白。用BCA法測(cè)定蛋白濃度。Western blotting檢測(cè)凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bcl-xS表達(dá)，用α-tubulin表達(dá)作為內(nèi)參。
　　 ⑹用Caspase-3比色分析試劑盒分析藥物處理后細(xì)胞的Caspase-3活性，最后在酶

10、標(biāo)儀405nm比色。樣品A405值與對(duì)照樣品A405值的比值顯示為Caspase-3活性。
　　 結(jié)果：
　　 ①RT-PCR證實(shí)成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)TK基因的前列腺癌細(xì)胞系PC-3/TK。
　　 ②GCV和DATS均顯著降低人前列腺癌細(xì)胞系PC-3/TK的活細(xì)胞數(shù)量。GCV和DATS的細(xì)胞毒性表現(xiàn)為顯著的劑量和時(shí)間依賴性。GCV和DATS作用72 h的IC50分別為13μmol/L和14μmol/L。GCV聯(lián)合D

11、ATS處理細(xì)胞48 h后，其細(xì)胞存活率與單用GCV處理組相比顯著減低(p＜0.05)。DATS增強(qiáng)了GCV對(duì)PC-3/TK細(xì)胞的殺傷效果。
　　 ③藥物聯(lián)合作用指數(shù)結(jié)果顯示GCV和DATS具有協(xié)同細(xì)胞毒性作用。
　　 ④用流式細(xì)胞分析細(xì)胞sub-G1 DNA含量來(lái)評(píng)價(jià)誘導(dǎo)凋亡效果。與對(duì)照組(1.2±0.7)％相比，DATS組(32.6±3.8)％，GCV組(18.3±1.2)％和GCV聯(lián)合DATS組(53.9±6.0)％

12、的sub-G1期細(xì)胞顯著增加中＜0.05)；與DATS組、GCV組相比，GCV聯(lián)合DATS組sub-G1期細(xì)胞的數(shù)量顯著增加(p＜0.05)。在DAPI染色分析中，與未處理細(xì)胞相比，在DATS組、GCV組和GCV聯(lián)合DATS組處理72 h后均觀察到明顯的核濃縮和破碎。
　　 ⑤與對(duì)照組相比，DATS和GCV處理組Bcl-2的表達(dá)均降低(p＜0.05)。與單用GCV或DATS組相比，GCV聯(lián)合DATS處理組的Bcl-2表達(dá)顯著降低

13、(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，DATS和GCV處理組顯著降低Bcl-xL表達(dá)(p＜0.05)。與單用GCV或DATS組相比，Bcl-xL蛋白在GCV聯(lián)合DATS組中表達(dá)最低(p＜0.05)。另一方面，所有藥物處理后Bax或Bcl-xS蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。
　　 ⑥與對(duì)照組相比，DATS組(204±9)％、GCV組(176±10)％、GCV聯(lián)合DATS組(390±20)％在72 h caspase-3活性均顯著增加(p＜0

14、.05)。與DATS組、GCV組相比，GCV聯(lián)合DATS組的caspase-3活性增加最為明顯(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：⑴成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)TK基因的人前列腺癌細(xì)胞系PC-3/TK。⑵GCV、DATS均能有效殺傷PC-3/TK細(xì)胞，細(xì)胞毒性呈劑量和時(shí)間依賴性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是二者發(fā)揮抗腫瘤效果的重要機(jī)制之一。⑶DATS能增強(qiáng)HSV-TK/GCV自殺基因系統(tǒng)對(duì)前列腺癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，而加速細(xì)胞凋亡在這一過(guò)程中起關(guān)鍵作用。⑷GC