鈍鱗紫背苔中肉桂醇脫氫酶的基因克隆和功能鑒定.pdf

1、苔蘚植物是從水生向陸生過渡的重要類群，含有萜類、聯(lián)芐、黃酮、木脂素和木質(zhì)素等多種多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有廣泛的生物活性。此外，這些次級(jí)代謝產(chǎn)物在苔蘚植物適應(yīng)陸地環(huán)境中起了重要作用。其中木質(zhì)素能夠維持植物正常結(jié)構(gòu)、輸導(dǎo)水分和養(yǎng)料、防御不良外界環(huán)境侵襲。由于缺少基因信息，苔蘚植物木質(zhì)素生物合成途徑中的很多重要關(guān)鍵酶基因尚未被克隆和鑒定。肉桂醇脫氫酶(Cinnamylalcoholdehydrogenase，CAD)是木質(zhì)素單體生物合成中的關(guān)

2、鍵酶，催化最后一步還原反應(yīng)，將五種羥基化、甲基化程度不同的醛還原成為對(duì)應(yīng)的醇。CAD基因是一個(gè)多基因家族，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析和基因結(jié)構(gòu)功能的差異可以將大部分CAD基因分為三類。
　　 本文從鈍鱗紫背苔（Plagiochasmaappendiculatum）的cDNA文庫中得到兩個(gè)注釋為肉桂醇脫氫酶基因的序列，分別命名為PaCAD1和PaCAD2。將它們構(gòu)建到原核表達(dá)載體上并且轉(zhuǎn)入表達(dá)型大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，

3、表達(dá)出的蛋白純化后進(jìn)行體外酶活鑒定。并合成了酶反應(yīng)所需底物和產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品。酶反應(yīng)結(jié)果顯示PaCAD1和PaCAD2對(duì)五種底物對(duì)羥基肉桂醛(p-coumarylaldehyde)、咖啡醛（caffeylaldehyde）、松柏醛(coniferylaldehyde)、5-羥基松柏醛(5-hydroxyconiferylaldehyde)和芥子醛（sinapylaldehyde）均有催化活性。酶學(xué)動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果表明PaCAD1和PaCAD2的

4、最適底物分別為咖啡醛和松柏醛，兩酶對(duì)對(duì)羥基肉桂醛也有較強(qiáng)催化活性，對(duì)5-羥基松柏醛和芥子醛催化活性較低。進(jìn)化分析結(jié)果顯示，PaCADl和PaCAD2屬于第Ⅱ類肉桂醇脫氫酶。經(jīng)過序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)第Ⅱ類中部分已驗(yàn)證過功能的基因同PaCAD1和PaCAD2具有保守結(jié)構(gòu)域VTG(X)2G(X)9L(X)5。同時(shí)，測(cè)定了鈍鱗紫背苔的葉狀體和愈傷組織中的木質(zhì)素含量，結(jié)果顯示葉狀體中的含量明顯高于愈傷組織，這與PaCAD2在葉片中的表達(dá)顯著高于愈傷組織