穩(wěn)定整合靶向性14-3-3ζ基因RNA干涉載體的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系建立.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是一類常見(jiàn)的原發(fā)性惡性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，嚴(yán)重威脅人類的健康和生命，是當(dāng)前神經(jīng)科學(xué)迫切需要解決的問(wèn)題。目前大部分惡性膠質(zhì)瘤的預(yù)后很差，盡管在早期診斷、手術(shù)治療和放射治療方面已有長(zhǎng)足發(fā)展，但其中位生存期只有14個(gè)月，并且5年生產(chǎn)率不足2％。另外，由于大部分治療并非選擇性針對(duì)腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致很多正常腦組織也受到損傷，所以對(duì)于膠質(zhì)瘤的治療不但需要?dú)⑺浪心[瘤細(xì)胞，還需要有足夠的能力分辨正常組織和腫瘤細(xì)胞。
　　14-3-3蛋白屬于小分

2、子多功能酸性二聚體蛋白，在幾乎所有真核細(xì)胞中均有表達(dá)，具有高度的保守性。14-3-3蛋白通常在胞質(zhì)中，但是也存在胞核、高爾基體和細(xì)胞膜中。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有7個(gè)亞型(ζ，β，η，ε，θ，γ和σ)，另外還有兩種在酵母菌和果蠅中，15種在擬南芥植物屬。14-3-3蛋白α和δ分別是β和ζ的磷酸化形式。14-3-3蛋白作用機(jī)理非常多，在不同的細(xì)胞信號(hào)通路中有超過(guò)200個(gè)14-3-3配體分子與其結(jié)合。同時(shí)14-3-3蛋白在細(xì)胞凋亡、DNA復(fù)制、細(xì)胞

3、分化、增殖、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞周期調(diào)控等過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白在正常膠質(zhì)細(xì)胞中低表達(dá)，而在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，而14-3-3ζ亞型在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中呈明顯的高表達(dá)。目前，靶向14-3-3ζ的膠質(zhì)瘤基因治療實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道較少?；诖耍菊n題在此方向進(jìn)行了探討。
　　一、人14-3-3ζ基因shRNA真核表達(dá)載體pSilencer-14-3-3ζ的構(gòu)建和鑒定
　　采用Primer5.

4、0軟件，根據(jù)人14-3-3ζ的cDNA序列和干涉載體的設(shè)計(jì)要求，設(shè)計(jì)兩條核苷酸鏈序列。每條長(zhǎng)64nt，兩端分別含有BamHI和HindIII的酶切位點(diǎn)。將合成的兩條寡核苷酸退火后形成的雙鏈DNA片段從BamHI和HindIII兩個(gè)酶切位點(diǎn)克隆到質(zhì)粒載體pSilencer3.1-H1neo載體中，新的質(zhì)粒命名為pSilencer-14-3-3ζ。雙酶切鑒定及測(cè)序，證明克隆正確。
　　二、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立
　　構(gòu)建好干涉載體

5、pSilencer-14-3-3ζ和陰性對(duì)照載體通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法分別轉(zhuǎn)染入人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤系U251中，進(jìn)行細(xì)胞克隆。隨機(jī)挑選30個(gè)克隆繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，備后用。
　　三、Westernblot與RT-PCR檢測(cè)14-3-3ζ蛋白表達(dá)水平
　　通過(guò)Westernblot和RT-PCR檢測(cè)，干涉載體pSilencer-14-3-3ζ組細(xì)胞的14-3-3ζ蛋白和RNA表達(dá)水平有顯著抑制，與陰性對(duì)照載體組細(xì)胞及U251平行