基因重組菌高效表達(dá)p53C蛋白及色譜純化.pdf

1、p53蛋白是人體內(nèi)的重要的癌癥抑制劑之一，也是細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下必備的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。因此，應(yīng)用基因工程技術(shù)在體外高效表達(dá)p53蛋白以及對(duì)其分離純化方法的建立，一直是近年來(lái)抗癌藥物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。
　　本文首先設(shè)計(jì)構(gòu)建了表達(dá)p53目標(biāo)蛋白的基因重組菌。p53C是p53蛋白第94-312位氨基酸之間的序列，涵蓋了p53的整個(gè)DNA結(jié)合區(qū)域，p53中超過(guò)85％的錯(cuò)義突變都可以定位到這一核心區(qū)域中。為此，設(shè)計(jì)將p53C基因片段插入到pR

2、SET（A）質(zhì)粒載體上，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中，獲得了能夠?qū)δ繕?biāo)蛋白p53C進(jìn)行外源表達(dá)的基因重組菌；并進(jìn)一步對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，主要考察了誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度對(duì)基因重組菌表達(dá)目標(biāo)蛋白p53C的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)控制在細(xì)菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期，誘導(dǎo)時(shí)間8h，誘導(dǎo)劑濃度1mmol/L的最佳培養(yǎng)條件下，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白p53C的高效表達(dá)；最后，采用SP-Sepharose陽(yáng)離子交換

3、色譜對(duì)含有 p53C蛋白的細(xì)胞破碎上清液進(jìn)行分離純化，并對(duì)比了不同操作條件對(duì)純化效果的影響。結(jié)果表明，采用階躍梯度洗脫，在80%的鹽濃度下，可達(dá)到良好的純化效果，目標(biāo)蛋白的純度提高至21.2%。在pH8.0的色譜操作條件下，目標(biāo)蛋白收率最高，純度也較高達(dá)21.8%。此外初步嘗試了陰離子交換色譜、凝膠色譜和親和色譜，但對(duì)目標(biāo)蛋白p53C的分離效果均不佳，有待于對(duì)操作條件和方法的進(jìn)一步完善和確定。
　　本研究建立了基因重組菌對(duì)p53C