豬葡萄球菌ExhB基因的原核表達(dá)及其感染裸鼠和Balb-c小鼠模型的研究.pdf

1、豬葡萄球菌(Staphylococcus hyicus,S.hylcus)是小豬全身性滲出性皮炎(Exudative epidermit，EE)的病原，隨著養(yǎng)殖集約化程度的增強(qiáng)和早期斷奶技術(shù)的采用，小豬全身性滲出性皮炎對(duì)養(yǎng)豬業(yè)所帶來(lái)的負(fù)面影響也將日益明顯。該病原的不同毒株可以產(chǎn)生不同的毒素，被命名為ExhA、ExhB、ExhC、ExhD四種，現(xiàn)已證實(shí)不同毒株產(chǎn)生的毒素是引起仔豬發(fā)病的主要因素。本文主要對(duì)可以產(chǎn)生B型毒素的豬葡萄球菌菌株進(jìn)

2、行研究。本病的感染動(dòng)物模型多選用SPF豬。鑒于小鼠在作為動(dòng)物模型方面有著簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)，易于操作等明顯的優(yōu)勢(shì)，且該病在小鼠身上的研究國(guó)內(nèi)外尚鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究選用裸鼠及Balb/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；對(duì)分離鑒定的豬葡萄球菌ExhB基因進(jìn)行克隆表達(dá)，對(duì)所表達(dá)蛋白的致病性進(jìn)行鑒定。并將該分離菌經(jīng)肌肉注射裸鼠和Balb/c小鼠，探討裸鼠和Balb/c小鼠對(duì)豬葡萄球菌的易感性及豬葡萄球菌對(duì)裸鼠和Balb/c小鼠的致病性。 根據(jù)GeneBa

3、nk中收錄的Staphylococcus hylcus ExhB基因(序列號(hào)：AF515454等)的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物P1，P2。對(duì)已經(jīng)過(guò)生化鑒定的豬葡萄球菌基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小為1280bp的基因片段，將其克隆到pMD18-T載體，獲得重組質(zhì)粒pMD-ExhB。 用帶有Kpn I、HindⅢ酶切位點(diǎn)的引物P1’，P2'，以重組質(zhì)粒pMD-ExhB為模板，擴(kuò)增去掉N端疏水性AA的ExhB基因。用相同的限制性

4、內(nèi)切酶酶切該P(yáng)CR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-32a.后構(gòu)建重組表達(dá)載體pET—ExhB，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，經(jīng)酶切及PCR鑒定篩選出陽(yáng)性克隆，測(cè)序證明目的基因以正確的閱讀框插入了表達(dá)載體，用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)ExhB蛋白主要抗原區(qū)基因，收集菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，原核表達(dá)產(chǎn)物大小約為45Ku。通過(guò)ELISA和瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)表明，所表達(dá)的包涵體蛋白可以與用菌體制得的多克隆抗血清發(fā)生特異性結(jié)合；用復(fù)性蛋白在裸鼠身上攻毒后可

5、以產(chǎn)生皮炎病變。 用分離鑒定的豬葡萄球菌菌體、上清以及二者的混合物經(jīng)肌肉注射裸鼠和Balb/c小鼠，通過(guò)眼觀、剖檢和做病理組織學(xué)切片確定其感染的狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)裸鼠和Balb/c小鼠均可被感染，分別產(chǎn)生不同程度的相似的臨床癥狀。裸鼠在感染后的二到三天背部和面部皮膚上開(kāi)始出現(xiàn)大量小的紅色囊泡，四到五天后部分囊泡消失，部分形成結(jié)痂。一些裸鼠眼睛還會(huì)有較多的膿性分泌物滲出.感染兩周后相繼死亡。Balb/c小鼠感染該菌后多表現(xiàn)急性臨床癥狀

6、，感染后二到三天就相繼死亡，因此表現(xiàn)不出明顯的眼觀病變。 只有很少一部分小鼠皮膚上會(huì)出現(xiàn)炎性滲出，導(dǎo)致該處皮膚脫落。剖檢發(fā)現(xiàn)小鼠腎臟明顯腫大，肝臟充血明顯。病理切片發(fā)現(xiàn)感染小鼠表皮角質(zhì)脫落明顯，棘細(xì)胞層增生，稱為“棘皮癥”，這是豬感染該菌后所產(chǎn)生的特征性癥狀。心、肝、肺等組織部位的細(xì)胞也都有不同稱度的腫脹、變性、壞死。研究表明，Balb/c小鼠比裸鼠對(duì)豬葡萄球菌更易感，裸鼠感染后有清晰的肉眼可見(jiàn)的臨床癥狀產(chǎn)生，而B(niǎo)alb/c小鼠