鴨腸炎病毒gC基因疫苗在BALB-c小鼠體內(nèi)的表達(dá)時(shí)相和分布規(guī)律的研究.pdf

1、本文圍繞鴨腸炎病毒gC基因疫苗(pcDNA-DEV-gC)在BALB/c小鼠體內(nèi)的抗原表達(dá)和動(dòng)態(tài)分布及DEV弱毒疫苗病毒抗原在BALB/c小鼠體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布開(kāi)展了下列研究：①利用純化的DEV接種家兔制備兔抗DEV血清；②建立了能特異性檢測(cè)石蠟組織切片中pcDNA-DEV-gC表達(dá)產(chǎn)物和DEV病毒抗原的間接免疫酶組織化學(xué)(IHC)和間接免疫熒光方法(IFA)；③pcDNA-DEV-gC分別以200μg/只、100μg/只、50μg/只的劑

2、量肌肉注射接種三組BALB/c小鼠，另外pcDNA-DEV-gC以6μg/只、3μg/只、1μg/只的劑量基因槍轟擊接種三組BALB/c小鼠；④利用脂質(zhì)體和殼聚糖包被pcDNA-DEV-gC制成脂質(zhì)體/DNA疫苗和殼聚糖/DNA疫苗，通過(guò)肌肉注射和口服給藥接種四組BALB/c小鼠，每只小鼠的免疫劑量中包裹50μgpcDNA-DEV-gC；⑤對(duì)照組：?jiǎn)蝹€(gè)免疫劑量的DEV弱毒疫苗皮下注射、100μg空白質(zhì)粒和生理鹽水肌肉注射接種三組BALB

3、/c小鼠。免疫后8h、12h、1d、3d、5d、7d、2wk、4wk、6wk、10wk和18wk分別取各組小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、胸腺、胰腺、食道、氣管、十二指腸、直腸、盲腸和接種部位（大腿肌肉注射或者腹部皮膚）等組織器官，通過(guò)建立的間接免疫酶組織化學(xué)和間接免疫熒光方法檢測(cè)石蠟切片中pcDNA-DEV-gC表達(dá)產(chǎn)物和DEV病毒抗原。獲得如下結(jié)果：
　　 1.DEV接種到鴨胚成纖維細(xì)胞，37℃孵育72h后顯微鏡下可

4、見(jiàn)鴨胚成纖維細(xì)胞達(dá)到75％的細(xì)胞病變(CPE)，對(duì)照組鴨成纖維細(xì)胞不發(fā)生細(xì)胞病變。兔抗DEV陽(yáng)性血清經(jīng)過(guò)辛酸-硫酸銨沉淀、DEAE-SephadexA-50離子交換層析處理后，可獲得純化的兔抗DEVIgG。
　　 2.建立的間接免疫酶組織化學(xué)(IHC)和間接免疫熒光方法(IFA)有較好的特異性，能準(zhǔn)確檢測(cè)BALB/c小鼠組織中pcDNA-DEV-gC的表達(dá)產(chǎn)物及DEV病毒抗原。
　　 3. pcDNA-DEV-gC通過(guò)大

5、腿肌肉注射和腹部皮膚基因槍轟擊免疫BALB/c小鼠，免疫后12h即可在免疫部位大腿肌肉和腹部皮膚中檢測(cè)到抗原產(chǎn)物，1d后抗原產(chǎn)物相繼出現(xiàn)在脾、腎、胸腺、胰腺、盲腸、直腸等組織的胞漿中。pcDNA-DEV-gC免疫后1d～6wk，脾、腎和胸腺等組織中檢測(cè)到的抗原產(chǎn)物較多，其次為免疫部位大腿肌肉與腹部皮膚、心、直腸、盲腸和胰腺，十二指腸腸絨毛上皮細(xì)胞檢測(cè)到零星的抗原產(chǎn)物。肝、肺、腦、食道與氣管等組織檢測(cè)結(jié)果為陰性。pcDNA-DEV-gC在

6、脾、腎和胸腺等組織中持續(xù)表達(dá)時(shí)間最長(zhǎng)，免疫后6wk仍可在這三個(gè)組織中檢測(cè)到抗原產(chǎn)物。免疫后10wk所有組織都檢測(cè)不到抗原產(chǎn)物。不同劑量組間同一組織在同一時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)到的抗原表達(dá)量依次為：200μg組＞100μg組＞50μg組，6μg組＞3μg組＞1μg組，接種劑量跟抗原表達(dá)量之間呈現(xiàn)一定的正相關(guān)，但非等比例增長(zhǎng)。
　　 4.脂質(zhì)體和殼聚糖在肌肉注射或口服給藥的途徑下，能有效增強(qiáng)pcDNA-DEV-gC在BALB/c小鼠體內(nèi)的抗原表

7、達(dá)，殼聚糖更適合作為pcDNA-DEV-gC基因疫苗的免疫佐劑。
　　 5.BALB/c小鼠皮下接種DEV弱毒疫苗，免疫后8h即可在胸腺的淋巴細(xì)胞中檢測(cè)到病毒抗原，免疫后12h病毒抗原出現(xiàn)在脾臟的紅髓和白髓中的淋巴細(xì)胞中，1d后在心肌細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞和腸道上皮細(xì)胞中相繼檢測(cè)到病毒抗原，免疫后5d除了腦組織外其他組織器官的病毒抗原檢測(cè)均顯示陽(yáng)性。免疫后8h～4wk期間胸腺淋巴細(xì)胞檢測(cè)到的病毒抗原最多，脾臟次之。與pcDNA-D