大鼠肝硬化腹水模型的制備及其在白蛋白藥效學(xué)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用.pdf

1、肝硬化是由一種或多種原因長(zhǎng)期、反復(fù)作用引起的慢性肝臟疾病,其病理學(xué)特征為:肝細(xì)胞變性、死亡,纖維結(jié)締組織增生明顯,典型的假小葉結(jié)構(gòu)廣泛形成。肝硬化腹水是肝硬化進(jìn)入失代償期的重要標(biāo)志之一,主要形成原因是肝細(xì)胞壞死,肝小葉結(jié)構(gòu)破壞、再生結(jié)節(jié)形成,肝臟合成蛋白的功能減退,引起蛋白分布改變和膠體滲透壓降低,導(dǎo)致血液成分漏入組織間隙,組織液回收減少而滲入腹腔形成腹水,提示疾病預(yù)后不良。
　　肝硬化動(dòng)物模型的制備是肝硬化發(fā)病機(jī)制研究及相關(guān)治療

2、藥物研發(fā)的前提和基礎(chǔ),構(gòu)建一種穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好、模擬性強(qiáng)的肝硬化動(dòng)物模型具有十分重要的意義。
　　常用于制備肝硬化動(dòng)物模型的方法有四氯化碳法、酒精法、免疫法、膽總管阻塞法和多因素復(fù)合法等,其中四氯化碳(carbontetrachloride,CCl4)作為經(jīng)典的肝毒物質(zhì)廣泛用于肝硬化模型(cirrhosismodel,CM)的制備。CCl4制備肝硬化模型,一般用40～60％混合油溶液按照動(dòng)物體重進(jìn)行給藥,每周2次,12-15周

3、可形成肝硬化,但是CCl4肝毒性劇烈,單獨(dú)使用時(shí)死亡率達(dá)30%-40%。我們?cè)趥鹘y(tǒng)CCl4法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良,優(yōu)化出CCl4聯(lián)合苯巴比妥與酒精共同誘導(dǎo)的方法,規(guī)?；苽浯笫蟾斡不顾Ｐ?為重組人血白蛋白(recombinanthumanserumalbumin,rHSA)和犬血白蛋白(plasma-derivedcanineserumalbumin,pd-CSA)治療肝硬化腹水藥效學(xué)評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。
　　本研究主要在優(yōu)化制備大鼠肝

4、硬化腹水模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行白蛋白治療效果的評(píng)價(jià),為此,主要進(jìn)行以下工作:
　　(1)四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝硬化腹水模型的建立
　　為了優(yōu)化最佳肝硬化腹水模型的制備方法,有效縮短建模周期、提高成模率、降低死亡率,分別運(yùn)用CCl4法、CCl4+苯巴比妥法、CCl4+酒精法和CCl4+苯巴比妥+酒精法對(duì)大鼠進(jìn)行誘導(dǎo)。正常對(duì)照組給予普通飲水,腹腔注射橄欖油;模型組分別給予不同飲用水處理,腹腔均注射CCl4-橄欖油混合溶液,注射劑量均為2m

5、l/kgwt,每周注射兩次,共12周。從給藥第4周開(kāi)始,隔1周對(duì)體重、腹圍、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanineaminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanineaminotransferase,AST)、白蛋白(albumin,ALB)和膠體滲透壓(colloidosmoticpressure,COP)進(jìn)行一次測(cè)定。
　　建模結(jié)束后,對(duì)各參數(shù)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果顯示,各模型組大鼠的體重增長(zhǎng)緩慢,腹圍明

6、顯增加,ALT和AST顯著升高,ALB和COP下降明顯,與對(duì)照組比較,具有顯著性差異。各模型組間參數(shù)指標(biāo)進(jìn)行比較,結(jié)果可以看出,CCl4+苯巴比妥+酒精組ALT和AST最先出現(xiàn)高峰峰值,ALB和COP在第8周時(shí)的下降程度已達(dá)到成模要求,其他各組均晚于CCl4+苯巴比妥+酒精組,說(shuō)明CCl4+苯巴比妥+酒精組的方法對(duì)大鼠肝細(xì)胞損傷速度最快、最明顯,有效縮短建模時(shí)間。大鼠肝組織進(jìn)行病理學(xué)檢查可以看出,對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞排列整齊,各模型組均有典

7、型的肝硬化病理特征出現(xiàn),肝細(xì)胞排列紊亂,結(jié)締組織增生,假小葉形成。比較各組的成模率和死亡率可以知道,CCl4+苯巴比妥+酒精組成模率為80%,均高于其他各組,死亡率20%低于其他建模組。綜合分析結(jié)果表明,CCl4聯(lián)合苯巴比妥與酒精的方法有效縮短建模周期,提高成模率,降低死亡率,利于肝硬化腹水模型的制備。
　　運(yùn)用CCl4聯(lián)合苯巴比妥與酒精的方法規(guī)?；苽浯笫蟾斡不顾Ｐ?從給藥第8周開(kāi)始,對(duì)出現(xiàn)腹水陽(yáng)性體征的大鼠進(jìn)行血液指標(biāo)的檢

8、測(cè),根據(jù)成模標(biāo)準(zhǔn)篩選出符合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)的大鼠模型。建模結(jié)束后,共獲得90只符合成模標(biāo)準(zhǔn)的模型。用于rHSA和pd-CSA治療效果的評(píng)價(jià)。
　　(2)rHSA治療CCl4誘導(dǎo)肝硬化腹水模型的效果評(píng)價(jià)
　　rHSA是運(yùn)用基因重組技術(shù)制備而成的,具有和人血白蛋白相同的分子生物學(xué)特性和免疫特性。rHSA的研制避免了血漿來(lái)源白蛋白的一些局限性和弊端。
　　將56只本研究第一部分制備的大鼠模型隨機(jī)分為六組:陰性對(duì)照組大鼠給予10ml

9、/kgwt模擬劑;不同劑量rHSA治療組,根據(jù)臨床上人血白蛋白的治療劑量,確定了重組人血白蛋白各實(shí)驗(yàn)組的給藥劑量分別為1.25ml/kgwt、2.5ml/kgwt、5ml/kgwt和10ml/kgwt,即0.25g/kgwt、0.5g/kgwt、1g/kgwt和2g/kgwt;陽(yáng)性對(duì)照組給予10ml/kgwt的pd-HSA,給藥兩次,每次給藥間隔18h,并且控制給藥速度。完成給藥后測(cè)定大鼠的腹圍、尿量、COP和ALB,并對(duì)各參數(shù)給藥前后

10、變化量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,比較不同劑量的rHSA的治療效果。
　　結(jié)果表明,20%rHSA治療組大鼠的各項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)變化量與陰性對(duì)照組比較,具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,與20%pd-HSA比較,不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;rHSA組大鼠隨著給藥劑量的增加,各參數(shù)指標(biāo)給藥前后變化量隨之增加,具有劑量依賴(lài)性。COP變化量與ALB的變化量呈正相關(guān),腹圍變化量與COP和尿量呈負(fù)相關(guān),說(shuō)明20%rHSA對(duì)大鼠肝硬化腹水有一定治療作用。
　　(3)pd-CS

11、A治療CCl4誘導(dǎo)肝硬化腹水模型的效果評(píng)價(jià)
　　為了評(píng)價(jià)犬血白蛋白治療肝硬化腹水的作用,隨機(jī)將篩選的本研究第一部分的30只大鼠模型分為六組:四個(gè)不同劑量的10%pd-CSA治療組,劑量分別為2ml/kgwt、4ml/kgwt、8ml/kgwt和16ml/kgwt,即0.2g/kgwt、0.4g/kgwt、0.8g/kgwt和1.6g/kgwt,陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組,分別給予16ml/kgwt生理鹽水和10%pd-HSA(1.6g

12、/kgwt)共注射兩次,2h內(nèi)完成注射,每次給藥間隔18h。測(cè)量給藥前后大鼠的腹圍、尿量、COP和ALB的濃度,并對(duì)各參數(shù)指標(biāo)給藥前后變化量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較,分析組間差異,明確pd-CSA的治療作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,10%pd-CSA不同劑量組在治療大鼠肝硬化腹水伴隨低蛋白血癥時(shí),ALB濃度、COP水平和尿量增加的同時(shí),腹圍相應(yīng)降低,各參數(shù)指標(biāo)給藥前后變化量與陰性對(duì)照組比較,具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,與pd-HSA比較不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差