肝郁證模型大鼠藍(lán)斑蛋白質(zhì)組差異表達(dá)研究.pdf

1、背景：辨證論治是中醫(yī)學(xué)的特色和精髓，突出了個性化的中醫(yī)思路。“證”是中醫(yī)學(xué)的一個特有概念，是對疾病過程中所處一定階段的病位、病因、病性以及病勢所作的病理性概括。證是機體內(nèi)因和環(huán)境外因綜合作用的機體反應(yīng)狀態(tài)，隨著病程的發(fā)展而不斷發(fā)生變化。證是對疾病當(dāng)前本質(zhì)所作的結(jié)論。因此，證的研究是中醫(yī)學(xué)現(xiàn)代化研究的核心內(nèi)容。近年來，隨著基因組測序工作的完成，人們研究的重點已經(jīng)從基因轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)功能方面，蛋白質(zhì)在疾病的發(fā)生發(fā)展中承擔(dān)著重要的角色，這使得蛋

2、白質(zhì)組學(xué)在人類疾病的研究中有著極為重要的價值。蛋白質(zhì)組學(xué)是一門在整體水平上高通量、大規(guī)模地研究蛋白質(zhì)組成及其動態(tài)變化的活動規(guī)律，從而得到疾病、生理生化過程中的整體情況的新興學(xué)科。蛋白質(zhì)組學(xué)從一個機體或一個組織，一個細(xì)胞等不同層次“整體”的蛋白質(zhì)活動的角度，來揭示和闡明證候形成和發(fā)展的基本規(guī)律。其理論和技術(shù)特點以及其整體、動態(tài)性的核心思想，與中醫(yī)學(xué)的“整體觀”和“辨證觀”等理論體系有很大的相似性，這種研究思路與中醫(yī)整體觀和中藥多靶點整合調(diào)

3、節(jié)的特點不謀而合，具有明顯的中醫(yī)特色肝郁證是由于肝的疏泄功能異常，疏泄不及而致氣機郁滯所引起的情緒不寧、胸脅悶脹或易怒善哭為特征的一類臨床病證，常見于臨床多種疾病。臨床流行病學(xué)調(diào)查顯示，肝臟病證在五臟病證中占總體病證的40％，而肝郁證又是肝病證候的核心，也是中醫(yī)肝病發(fā)病學(xué)的重要環(huán)節(jié)，因此肝郁證的本質(zhì)研究一直是中西醫(yī)結(jié)合領(lǐng)域研究的熱點。近年來對肝郁證本質(zhì)的研究頗多，2初步證實肝郁證具有現(xiàn)代病理生理學(xué)基礎(chǔ)，并部分地闡釋了中醫(yī)理論的科學(xué)性，取

4、得了階段性成果:認(rèn)為肝郁證和應(yīng)激密切相關(guān)，并涉及機體神經(jīng)、內(nèi)分泌、循環(huán)、消化、免疫等多系統(tǒng)多器官的病理改變。近年來對應(yīng)激相關(guān)的下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)(Hypothalamic Pituitary Gonadal Axis，HPA)和藍(lán)斑-交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)(locus coeruleus-sympathetic-adrenal medulla system，LC-NE)研究較多，我們課題組之前的研究表明肝郁證可引起藍(lán)斑中酪氨酸羥

5、化酶(tyrosinehydroxylasw, TH)、c-fos表達(dá)的上調(diào)，進(jìn)一步闡明了藍(lán)斑和肝郁證的相關(guān)性。肝郁證是中醫(yī)經(jīng)典病證，其方證研究也一直是其本質(zhì)研究的一個重要方面。中醫(yī)證候研究具有“以方測證，方證互參”的特點。一方面通過辨證的結(jié)果來確立相應(yīng)的治法方藥，一方面又根據(jù)方藥的組成和功效來推測疾病的病機和癥狀。理論上講，每一個方劑都有自己使用的病證，只有當(dāng)其功效與疾病的病機相應(yīng)時，方劑的效用才達(dá)到最佳。通過這一特征，我們可以通過建

6、立預(yù)設(shè)的動物疾病模型，然后給予預(yù)設(shè)的方藥，選擇和疾病證候相關(guān)的差異指標(biāo)，通過對用藥后動物的觀察和研究，確認(rèn)該模型是否為預(yù)設(shè)的疾病模型。同時，在確定模型的情況下，選用特定方劑，通過觀察差異指標(biāo)，可以證實該方劑是否是治療此病證的有效方劑。因此，本課題以藍(lán)斑為切入點，通過蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行差異蛋白鑒定，并從中選取鑒定出的已知蛋白羧肽酶A抑制劑(Latexin/endogenous carboxypeptidaseinhibitor, ECI)，沉

7、默信息調(diào)節(jié)基因2(silent information regulator2，Sirt2)，轉(zhuǎn)體基因蛋白(Transthyretin，TTR)，進(jìn)行進(jìn)一步的驗證，并通過逍遙散進(jìn)行反證，同時選用了西藥陽性對照鹽酸氟西汀（氟西汀是臨床經(jīng)典抗抑郁藥，可有效改善悶悶不樂，興趣減退等肝郁證癥狀），希望為藍(lán)斑和肝郁證的相關(guān)性提供更進(jìn)一步的證據(jù)，并對進(jìn)一步研究肝郁證的本質(zhì)打下一定的基礎(chǔ)。
　　 目的：采用孤養(yǎng)加慢性不可預(yù)知溫和刺激(chron

8、ic unexpected mild stress，CUMS)制備肝郁證大鼠模型，觀察肝郁證大鼠在一般狀態(tài)、行為學(xué)及從蛋白質(zhì)的角度，對肝郁證模型大鼠藍(lán)斑組織蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)進(jìn)行比較分析并進(jìn)行驗證，從動物模型的角度找到肝郁證相關(guān)的蛋白質(zhì)組群，從而為建立證候的微觀辨證指標(biāo)體系奠定基礎(chǔ)，也為從臨床疾病的角度對肝郁證相關(guān)蛋白質(zhì)組的全面研究提供技術(shù)和理論支持。并通過比較逍遙散組和氟西汀組與模型組大鼠之間的蛋白表達(dá)差異，探討逍遙散對肝郁證的作用機

9、理，并以方測證，方證互參，為肝郁證本質(zhì)的闡述提供客觀依據(jù)。
　　 方法：⑴分兩次造模，第一次用于差異蛋白的檢測和鑒定，第二次用于蛋白功能的驗證。參照相關(guān)文獻(xiàn)報道，從慢性心理應(yīng)激的角度出發(fā)，將18只雄性SD大鼠隨機分為正常組，模型組，逍遙散組，每組6只（第二次為72只，分組增加鹽酸氟西汀組，每組18只）。除正常組外，其他各組大鼠均單籠飼養(yǎng)，并給予慢性不可預(yù)知溫和刺激，每天2次，持續(xù)3周。逍遙散組在模型制備的基礎(chǔ)上加用逍遙散干預(yù)，氟

10、西汀組加用氟西汀干預(yù)，正常組不給任何干預(yù)，群養(yǎng)。⑵以液氮研磨藍(lán)斑組織，低溫裂解藍(lán)斑細(xì)胞，提取藍(lán)斑組織的蛋白質(zhì)樣本。采用BSA法對蛋白質(zhì)樣本進(jìn)行定量。對組內(nèi)的藍(lán)斑組織，按等質(zhì)量進(jìn)行樣本混合。⑶在常規(guī)蛋白質(zhì)組2-DE分離技術(shù)基礎(chǔ)上，引入“鹽橋”和低電壓除鹽方法，進(jìn)一步優(yōu)化藍(lán)斑組織蛋白質(zhì)組2-DE分離技術(shù)。對同類混合樣本以組間配對的形式，同時進(jìn)行2-DE分離，并重復(fù)3次。⑷對2-DE分離所獲得的凝膠，采用新型的膠體考染技術(shù)，不僅可以提高凝膠染

11、色的靈敏度，而且還能減少對后期質(zhì)譜檢測的干擾。凝膠經(jīng)過染色和脫水后，用光密度透射掃描儀掃描而形成圖像。用PDQuest7.0軟件分析凝膠圖像，獲取每個蛋白質(zhì)的表達(dá)量、等電點、分子量等信息。并將組間表達(dá)量相差2倍以上的蛋白質(zhì)斑點設(shè)定為差異表達(dá)蛋白質(zhì)，由軟件自動生成分析結(jié)果，再加以人工驗證。⑸用MALDI-TOF-MS對分析所獲得的差異蛋白質(zhì)斑點進(jìn)行肽質(zhì)量指紋(peptide mass figerint，PMF)的檢測。首先，在凝膠上切取差

12、異表達(dá)蛋白質(zhì)斑點，再經(jīng)水洗、脫色、還原與烷基化、酶解、萃取、點樣和質(zhì)譜分析等步驟獲取每個蛋白質(zhì)斑點的PMF。然后，利用Masoct軟件搜索各大生物和蛋白質(zhì)相關(guān)數(shù)據(jù)庫，尋找與目的PMF相匹配的蛋白質(zhì)，并查詢該蛋白質(zhì)的相關(guān)信息。⑹運用化學(xué)發(fā)光免疫法檢測各組大鼠血清中三碘甲狀腺氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)和促甲狀腺激素(TSH)含量。⑺運用蘇木精-伊紅(hematoxylinandeosinstain，HE)染色，觀察大鼠藍(lán)斑的形態(tài)學(xué)變化。

13、⑻用免疫組化法（immunology and histology chemistry, IHC）檢測藍(lán)斑中Laxetin、Sirt2和TTR的表達(dá)變化。用Imageproplus6.0軟件進(jìn)行分析。⑼運用免疫印跡法(weastem blot，WB)檢測Laxetin、Sirt2和TTR在藍(lán)斑中的表達(dá)變化。⑽用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time-polymerase chain reaction，real-timePCR)技術(shù)檢

14、測Laxetin、Sirt2和TTR中mRNA在藍(lán)斑中的表達(dá)情況。⑾實驗結(jié)果均用平均值土標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±S）表示，采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計包處理。體重的變化采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，其余指標(biāo)多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊性，多重比較采用LSD法檢驗，若方差不齊，采用Welch分析，多重比較采用Tamhane's T2法檢驗，以P＜0.05作為具有顯著性差異。
　　 結(jié)果：①成功制備了孤養(yǎng)加CUMS肝郁證大鼠模型。

15、造模3周后，從一般情況來看，模型組大鼠開始表現(xiàn)為躁動，易激惹，隨后逐漸安靜，表現(xiàn)為倦怠少動，喜歡貼壁，反應(yīng)遲鈍，食欲減退，伴有毛色暗淡無光澤，松散，大便稀軟等肝郁證表現(xiàn)。逍遙散組和氟西汀組上述反應(yīng)明顯低于模型組，且兩藥物組間無顯著性差異(P＞0.05)。而正常對照組未見異常行為狀態(tài)。各組間體重增長存在顯著差異(P=0.017)，模型組生長較緩慢，逍遙散組和氟西汀組服藥后體重增長緩慢的情況得到改善，且與模型組有顯著差異(P=0.000)。

16、糖水消耗實驗提示各組間糖水偏好存在顯著性差異((P=0.000)，模型組的糖水偏好度明顯小于其他組。曠場實驗發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的直立次數(shù)和爬格數(shù)均顯著低于正常組(P=0.000)，逍遙散組和氟西汀組則顯著優(yōu)于模型組，但和正常組比較仍有差異(P=0.000)。說明孤養(yǎng)加CUMS確能造成大鼠的肝郁證，能有效的模擬臨床中肝郁證興趣喪失、快感缺乏等癥狀。②獲得了高質(zhì)量的藍(lán)斑組織蛋白質(zhì)組2-DE凝膠電泳圖像。經(jīng)2-DE分離和對凝膠圖像的軟件分析，發(fā)現(xiàn)

17、了21個蛋白質(zhì)斑點在三組間（正常組，模型組，逍遙散組）有差異表達(dá)。③差異蛋白質(zhì)斑點的質(zhì)譜檢測:出峰率達(dá)100％，經(jīng)過對PMF的分析和數(shù)據(jù)庫檢測，確定肝郁證模型大鼠中表達(dá)具有顯著性差異的藍(lán)斑組織蛋白質(zhì)17個。④血清中T3和T4含量在模型組中最高，逍遙散組和氟西汀組次之，正常組中含量最低(P=0.000)，TSH含量則在各組大鼠間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.740)。⑤HE染色顯示各組大鼠藍(lán)斑無明顯的形態(tài)學(xué)改變。⑥IHC檢測發(fā)現(xiàn)模型組藍(lán)斑

18、Laxetin、Sirt2和TTR的陽性神經(jīng)元數(shù)目均小于正常組，染色強度減弱，平均光密度值也低于正常組。逍遙散組和氟西汀組則可以改善這種情況。⑦WB檢測模型組Laxetin、Sirt2和TTR的表達(dá)量均低于正常組，逍遙散組和氟西汀組則較模型組表達(dá)增加。⑧運用real-time PCR技術(shù)檢測Laxetin、Sirt2和TTR的mRNA在LC中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常組比較，模型組表達(dá)量均減少，逍遙散組和氟西汀組則較模型組升高。
　　

19、結(jié)論：對肝郁證孤養(yǎng)加CUMS動物模型進(jìn)行了藍(lán)斑的蛋白質(zhì)組的研究，通過分析模型大鼠藍(lán)斑組織蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)，獲得和肝郁證動物模型密切相關(guān)的差異蛋白21個，其中17個可以獲得數(shù)據(jù)庫的匹配信息，確定蛋白質(zhì)名稱。我們在這17個蛋白質(zhì)中選取了Laxetin、Sirt2和TTR這三種蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的驗證。后期驗證我們采用IHC、WB、real-time PCR三種實驗技術(shù)同時證明在肝郁證中Laxetin、Sirt2和TTR蛋白表達(dá)下降，且逍遙散和