肝郁證模型大鼠藍(lán)斑和腎上腺髓質(zhì)TH、c-fos的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、背景：辨證論治作為中醫(yī)學(xué)的精髓,其在幾千年的臨床實(shí)踐中不斷發(fā)展和驗(yàn)效,充分體現(xiàn)了傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)整體觀(guān)和個(gè)體化的治療理念,是中醫(yī)學(xué)極具優(yōu)勢(shì)的部分。而“證”是辨證論治的依據(jù),是疾病處于一定階段病因、病位、病性和病勢(shì)的綜合,能體現(xiàn)患者的整體性特征,是中醫(yī)學(xué)現(xiàn)代化研究的核心內(nèi)容。因此,證本質(zhì)的研究對(duì)于中醫(yī)理論與臨床實(shí)踐的發(fā)展和中醫(yī)現(xiàn)代化具有極其重要的意義。
　　 肝郁證是指由于肝的疏泄功能異常、疏泄不及而致氣機(jī)郁滯所表現(xiàn)的證候,為病廣泛,常見(jiàn)

2、于臨床多種疾病中,是中醫(yī)臟腑證候中常見(jiàn)的證候之一,也是中醫(yī)肝病發(fā)病學(xué)的主要環(huán)節(jié)。研究肝郁證的實(shí)質(zhì),不僅是中醫(yī)證本質(zhì)研究的重要內(nèi)容,更能為臨床多種疾病的診斷和防治提供新的思路和方法。通過(guò)肝郁證這一典型證候的研究,探索證本質(zhì)研究的合適方法,對(duì)闡釋中醫(yī)學(xué)的科學(xué)內(nèi)涵有實(shí)際意義。
　　 經(jīng)過(guò)眾多學(xué)者多年的研究和探索,已初步證實(shí)肝郁證具有現(xiàn)代病理生理學(xué)基礎(chǔ),并部分地闡釋了其中醫(yī)理論的科學(xué)性,取得了階段性成果:認(rèn)為和應(yīng)激密切相關(guān),并且涉及機(jī)體

3、神經(jīng)、內(nèi)分泌、循環(huán)、消化、免疫等多個(gè)系統(tǒng)。國(guó)外對(duì)應(yīng)激所涉及的下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)(HPA)、藍(lán)斑-交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)(LC-NE)等均研究較為全面。而在國(guó)內(nèi),雖然與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)關(guān)系的研究是近幾年來(lái)肝郁證研究的熱點(diǎn),但是多集中在HPA軸、下丘腦-垂體-甲狀腺軸(HPTA)或是下丘腦-垂體-性腺軸(HPGA)上,對(duì)LC-NE的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本課題以L(fǎng)C-NE軸為切入點(diǎn),希望能為進(jìn)一步揭示肝郁證的本質(zhì)和中醫(yī)基礎(chǔ)理論的實(shí)驗(yàn)研

4、究作出一份貢獻(xiàn)。
　　 目的：采用慢性束縛應(yīng)激的方法復(fù)制大鼠肝郁證模型,觀(guān)察肝郁模型大鼠在體重、行為學(xué)、血清學(xué)以及藍(lán)斑、腎上腺髓質(zhì)中TH和c-fos蛋白及基因表達(dá)的變化,嘗試從LC-NE軸的角度對(duì)肝郁證的微觀(guān)辨證進(jìn)行初步探討；比較逍遙散干預(yù)大鼠與模型大鼠之間的差異表達(dá),一方面探討逍遙散對(duì)肝郁證的作用機(jī)理,另一方面以方測(cè)證、方證互參,說(shuō)明肝郁證的本質(zhì)。
　　 方法：
　　 1.慢性束縛肝郁大鼠模型的建立動(dòng)物分組:實(shí)

5、驗(yàn)用清潔級(jí)雄性SD大鼠36只,鼠齡5周,體重(150±20)g,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常對(duì)照組(A組)、肝郁證逍遙散組(B組)、肝郁證模型組(C組),每組各12只。A組3只1籠,其余2組單籠孤養(yǎng)。
　　 模型建立:參照文獻(xiàn),模擬中醫(yī)情志抑郁的病因,將B、C組大鼠置于特制的束縛制動(dòng)筒內(nèi),固定其身體與尾部,使之不能隨意活動(dòng)。每日開(kāi)始時(shí)間隨機(jī),每日束縛制動(dòng)1次,持續(xù)時(shí)間從第1天的1h逐漸增至每天6h,連續(xù)21d。B、C組大鼠在束縛

6、制動(dòng)期間禁食、禁水。A組大鼠不予任何干預(yù)。
　　 藥物干預(yù):B組大鼠根據(jù)正常成人逍遙散每日用量,按體表面積換算成大鼠用藥量為10g/kg.d,根據(jù)大鼠個(gè)體體重每日下午16時(shí)給B組大鼠經(jīng)胃灌相應(yīng)藥量,A、C組大鼠同時(shí)以生理鹽水灌胃。
　　 從液體消耗、行為學(xué)、實(shí)驗(yàn)室檢查血清NE、逍遙散干預(yù)后療效觀(guān)察等方面評(píng)價(jià)模型的可靠性。
　　 2.運(yùn)用HE染色方法,觀(guān)察大鼠LC、腎上腺髓質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變。
　　 3.用免疫

7、組化法檢測(cè)LC、腎上腺髓質(zhì)中TH和c-fos的表達(dá)變化。用Imageproplus6.0軟件進(jìn)行分析。
　　 4.運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)TH、c-fos的mRNA在LC、腎上腺髓質(zhì)中的表達(dá)變化。
　　 5.所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.從一般狀況來(lái)看,C組大鼠開(kāi)始表現(xiàn)為易激惹、掙扎,隨后表現(xiàn)表現(xiàn)為倦怠少動(dòng)、喜歡貼壁、叫聲尖細(xì)、反應(yīng)遲緩、飲食減少,伴有毛色黯淡易

8、于脫落、大便顆粒松散等肝郁證的表現(xiàn)。B組大鼠上述反應(yīng)較輕,而A組未見(jiàn)異常行為狀態(tài)。各組間體重增長(zhǎng)存在顯著差異(P=0.000),C組生長(zhǎng)較為緩慢,B組服藥后體重增長(zhǎng)緩慢的情況得到改善。液體消耗實(shí)驗(yàn)提示各組間糖水偏好存在顯著性差異(P=0.000),C組的糖水偏好率明顯小于其它兩組。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C組的直立次數(shù)、理毛次數(shù)和穿越格數(shù)均顯著低于A(yíng)組(P<0.01)。血清NE發(fā)現(xiàn):C組的血清NE濃度明顯高于A(yíng)組(P<0.01)。說(shuō)明慢性束縛應(yīng)激確

9、能造成大鼠的肝郁證,能有效的模擬臨床中肝郁證興趣喪失、快感缺乏等癥狀。
　　 2.由HE染色顯示,B、C組大鼠LC、腎上腺髓質(zhì)無(wú)明顯的形態(tài)學(xué)改變。
　　 3.免疫組化法檢測(cè)LC、腎上腺髓質(zhì)中TH和c-fos的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)C組TH和c-fos的陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目均大于A(yíng)組(P<0.05),染色強(qiáng)度也明顯增強(qiáng),平均光密度值也明顯高于A(yíng)組(P<0.05)。經(jīng)逍遙散干預(yù)的B組有下調(diào)二者表達(dá)的作用。
　　 4.運(yùn)用RT-PC

10、R技術(shù)檢測(cè)TH、c-fos的mRNA在LC、腎上腺髓質(zhì)中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)與A組比較,C組THmRNA、c-fosmRNA的表達(dá)顯著增高(P<0.05),B組THmRNA、c-fosmRNA表達(dá)較C組明顯降低(P<0.05)。TH和c-fos的表達(dá)變化是相關(guān)的,兩者的表達(dá)趨勢(shì)具有相似性。
　　 結(jié)論：本次研究采用慢性應(yīng)激束縛的方法,成功的復(fù)制了大鼠的肝郁證模型。證實(shí)在肝郁過(guò)程中,LC和腎上腺髓質(zhì)TH均表達(dá)增強(qiáng),提示LC和腎上腺髓質(zhì)在應(yīng)

11、激狀況下會(huì)釋放大量?jī)翰璺影?作用于相應(yīng)受體或靶器官,參與對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和代謝功能的調(diào)節(jié),以適應(yīng)機(jī)體應(yīng)激產(chǎn)生的反應(yīng)。c-fos在LC和腎上腺髓質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和平均光密度均比對(duì)照組增加,表達(dá)趨勢(shì)與TH一致,并在同一細(xì)胞能夠共表達(dá),而且TH啟動(dòng)子上具有c-fos的作用位點(diǎn),表明c-fos在慢性束縛應(yīng)激過(guò)程中參與了LC和腎上腺髓質(zhì)TH的表達(dá)調(diào)控。首次從藍(lán)斑-交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)對(duì)肝郁證進(jìn)行研究,為進(jìn)一步研究肝郁證的分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ),也為