小鼠MSCs的分離培養(yǎng)與體外多潛能分化的研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)起源于中胚層，主要存在于成年哺乳動(dòng)物的骨髓中，與造血干細(xì)胞(Hemopoietic stem cells，HSCs)共存。MSCs不僅參與構(gòu)建造血微環(huán)境，發(fā)揮支持造血的作用，而且研究表明其易于體外分離培養(yǎng)和擴(kuò)增、可自體移植并具有跨胚層分化為多種細(xì)胞表型的能力，例如可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、成肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞，未分化的或經(jīng)遺傳修飾過(guò)

2、的MSCs有望成為未來(lái)細(xì)胞/基因治療、組織工程的理想種子細(xì)胞。 本研究目的在于闡明小鼠骨髓MSCs的生物學(xué)性能及其分化潛能，優(yōu)化小鼠MSCs的增殖培養(yǎng)條件，以便未來(lái)利用該類細(xì)胞作為疾病細(xì)胞/基因治療的模型。 為此，本試驗(yàn)利用成年昆明小鼠為對(duì)象，較為系統(tǒng)全面地研究了其MSCs的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)特性、以及體外誘導(dǎo)分化能力，為進(jìn)一步深入研究MSCs的誘導(dǎo)分化和應(yīng)用打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。結(jié)果如下： 1．本試驗(yàn)應(yīng)用貼

3、壁分離法成功分離得到昆明小鼠股骨和脛骨MSCs，體外培養(yǎng)到第8代，細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增了5000倍以上。本試驗(yàn)所分離的昆明小鼠MSCs具有該類細(xì)胞的典型特征：外形呈多角形、三角形或長(zhǎng)梭形，細(xì)胞核質(zhì)比大、胞漿中細(xì)胞器少、核仁明顯，具有快速增殖的能力，類似于人和其它動(dòng)物的MSCs，細(xì)胞形態(tài)均一，排列有序，體外培養(yǎng)8代以上無(wú)變化。 2．小鼠MSCs可以在體外用馬血清或地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素、吲哚美辛定向誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞

4、，細(xì)胞內(nèi)有脂滴出現(xiàn)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，脂滴逐漸增加并融合為脂泡，細(xì)胞由梭形轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形或多角形，油紅O染色呈陽(yáng)性，從而建立了MSCs分化為脂肪細(xì)胞的模型，有助于研究肥胖發(fā)生的機(jī)制。同時(shí)，這也是和骨髓造血干細(xì)胞的區(qū)別之一。 3．本試驗(yàn)成功誘導(dǎo)小鼠MSCs體外分化為成骨細(xì)胞表型，產(chǎn)生Von Kossa染色陽(yáng)性的礦化結(jié)節(jié)。試驗(yàn)證明，地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸是誘導(dǎo)MSCs向成骨分化的重要因素，MSCs可以作為骨組織工程重要的種子細(xì)胞

5、來(lái)源。 4．本試驗(yàn)分離獲得了小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)典型，并成功用于MSCs成神經(jīng)誘導(dǎo)后的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)鑒定的陽(yáng)性對(duì)照。該分離培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的需要。 5．本試驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠MSCs在β-巰基乙醇和全反式維甲酸誘導(dǎo)下分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，呈現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)，表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞的分子標(biāo)記NSE和NF-200，誘導(dǎo)產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞在神經(jīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)可以存活，但這種分化細(xì)胞是否具有神經(jīng)細(xì)胞的功能有待于進(jìn)一步研究。