體外分離培養(yǎng)MSCs定向誘導(dǎo)為胰島素分泌細(xì)胞.pdf

1、目的: 研究成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的體外分離培養(yǎng)及向胰島素分泌細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化和鑒定方法，為糖尿病的治療提供種子細(xì)胞來源。 方法: 1.分別采用全骨髓培養(yǎng)法與Percoll密度梯度離心法從成人骨髓中分離MSCs，相同條件下體外培養(yǎng)，比較兩種方法所獲得的貼壁細(xì)胞克隆數(shù)、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表面標(biāo)志及向脂肪細(xì)胞的分化情況。2.將全骨髓培養(yǎng)法獲得的MSCs體外培養(yǎng)傳代，取3～5代細(xì)胞先后予以2-巰基乙醇、谷氨酰胺、表皮生長因子(

2、EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)及尼克酰胺等，通過三階段向胰島樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化。3.相差顯微鏡下觀察MSCs在誘導(dǎo)前后的形態(tài)變化、免疫熒光鑒定胰十二指腸同源異型盒基因(PDX-1)的表達(dá)、雙硫腙染色鑒定胰島β樣細(xì)胞團(tuán)、電化學(xué)發(fā)光法測定胰島素的分泌量。 結(jié)果: 1.全骨髓培養(yǎng)法獲得的貼壁細(xì)胞克隆數(shù)明顯多于Percoll密度梯度離心法(P<0.05)。兩種方法獲得的人MSCs形態(tài)無明顯差異，CD44陽性表達(dá)率和CD34

3、陰性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，經(jīng)地塞米松、胰島素誘導(dǎo)后均可分化為脂肪細(xì)胞。2.MSCs經(jīng)2-巰基乙醇、尼克酰胺等誘導(dǎo)后，細(xì)胞逐漸變圓，誘導(dǎo)二階段細(xì)胞表達(dá)PDX-1，誘導(dǎo)三階段形成胰島樣細(xì)胞團(tuán)，雙硫腙染色陽性，葡萄糖刺激有胰島素釋放：而未經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs呈長梭形貼壁生長，無PDX-1表達(dá)，雙硫腙染色陰性，無胰島素釋放。 結(jié)論: 1.與Percoll密度梯度離心法比較，全骨髓培養(yǎng)法是更為簡便、實(shí)用的MSCs體外分離方法