帕潘立酮對(duì)MK-801損傷腦皮層神經(jīng)元的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、精神分裂癥是一種反復(fù)發(fā)作的慢性遷延性疾病，患病率約占世界總?cè)丝诘?％?；颊咄憩F(xiàn)為三種不同類型的癥狀:陽(yáng)性癥狀（如妄想、幻覺），陰性癥狀和認(rèn)知功能障礙（包括情感冷漠、社會(huì)退卻、注意力減退、空間記憶減退）等。精神分裂癥病因不明，發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，其發(fā)病涉及多種學(xué)說(shuō)、多條基因通路，但均不能完全解釋精神分裂癥的臨床表現(xiàn)，治療轉(zhuǎn)歸，該病的發(fā)病機(jī)理仍需要進(jìn)一步的探索研究。
　　 MK-801，又名地佐環(huán)平，為非競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體拮抗劑。NM

2、DA受體是谷氨酸受體的一個(gè)亞型，廣泛分布于大腦皮質(zhì)、丘腦、海馬、紋狀體和脊髓，參與中樞興奮性神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)。MK-801通過(guò)阻斷非競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體模擬精神分裂癥的陽(yáng)性與陰性癥狀，而廣泛應(yīng)用于精神分裂癥動(dòng)物模型的建立。行為學(xué)研究應(yīng)用MK-801制備的模型鼠感覺運(yùn)動(dòng)功能障礙，其學(xué)習(xí)和工作記憶、空間定位記憶能力均受到不同程度的損害，形態(tài)學(xué)檢測(cè)顯示腦皮層神經(jīng)元空泡化，神經(jīng)元胞體萎縮及樹突斷裂。體外研究表明，MK-801可降低小腦顆粒細(xì)胞的活性

3、，促進(jìn)凋亡蛋白的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并能抑制神經(jīng)細(xì)胞突起的生長(zhǎng)。國(guó)外學(xué)者曾應(yīng)用MK-801損傷神經(jīng)元，并作為精神分裂癥的體外模型，分析相關(guān)的病理機(jī)制。
　　 非經(jīng)典抗精神病藥物又稱為第二代抗精神病藥物，與經(jīng)典抗精神分裂癥藥物相比，非經(jīng)典抗精神病藥物在臨床上得到廣泛應(yīng)用得益于其在發(fā)揮治療精神分裂癥作用時(shí)較少引起錐體外系反應(yīng)等副作用，同時(shí)非經(jīng)典抗精神病藥物能降低患者腦體積減少的程度，有效發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。帕潘立酮(paliperi

4、done)是一種新型的非經(jīng)典抗精神病藥物，其臨床治療效果明顯優(yōu)于經(jīng)典抗精神病藥物。研究發(fā)現(xiàn)帕潘立酮通過(guò)提高細(xì)胞存活率、降低凋亡蛋白而發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。然而，帕潘立酮發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用及其抗精神分裂癥機(jī)制還清楚，需要進(jìn)一步的研究。
　　 鑒于此，我們?cè)O(shè)計(jì)以下實(shí)驗(yàn)檢測(cè)帕潘立酮的神經(jīng)保護(hù)作用及其相關(guān)的分子學(xué)機(jī)制以及帕潘立酮抗精神分裂癥的相關(guān)機(jī)制。在體外實(shí)驗(yàn)中，我們?nèi)〔腅15天胎鼠腦皮層神經(jīng)元，行微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)免疫細(xì)胞化

5、學(xué)染色鑒定提取神經(jīng)元的純度，用不同濃度的MK-801毀損腦皮層神經(jīng)元，同時(shí)加入帕潘立酮進(jìn)行處理，通過(guò)檢測(cè)神經(jīng)元活性、乳酸脫氫酶(LDH)的釋放、鈣離子濃度及timecourse來(lái)觀察其對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用，通過(guò)神經(jīng)突起總長(zhǎng)度及神經(jīng)突起密度計(jì)數(shù)檢測(cè)帕潘立酮對(duì)神經(jīng)突起生長(zhǎng)的影響，在進(jìn)一步的分子機(jī)制研究中檢測(cè)了與精神分裂癥密切相關(guān)的信號(hào)通路Akt1/GSK3β的表達(dá)變化，并應(yīng)用該通路的抑制劑LY294002處理培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元，通過(guò)Hoechs

6、t33342/PI染色及神經(jīng)元活性分析驗(yàn)證帕潘立酮是否是通過(guò)Akt1/GSK3β信號(hào)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)及抗精神分裂癥作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，我們運(yùn)用MK-801建立精神分裂癥小鼠動(dòng)物模型，并同時(shí)給予帕潘立酮藥物處理，通過(guò)動(dòng)物行為學(xué)檢測(cè)、皮層組織Akt1/GSK3β蛋白表達(dá)的變化來(lái)分析帕潘立酮抗精神分裂癥作用及可能的分子機(jī)制。
　　 結(jié)果顯示，提取的胎鼠皮層神經(jīng)元純度高，絕大多數(shù)表達(dá)MAP-2。應(yīng)用不同濃度的MK-801處理后，與正常對(duì)照

7、組相比，神經(jīng)元活性明顯下降，LDH釋放增多，神經(jīng)突起總數(shù)目及神經(jīng)突起密度均有不同程度的下降，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著升高（P均＜0.01），鈣離子timecourse檢測(cè)顯示在360-720s時(shí)間范圍內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度急劇升高(P＜0.01)，real-timePCR及western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示Akt1/GSK3β信號(hào)通路表達(dá)下調(diào)(P＜0.01)。加入帕潘立酮共處理后，與MK-801組相比，帕潘立酮能明顯提高神經(jīng)元活性，促進(jìn)

8、神經(jīng)突起的生長(zhǎng)，降低LDH釋放及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高（P均＜0.01），鈣離子timecourse檢測(cè)顯示在360-720s時(shí)間范圍內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度的升高被明顯抑制(P＜0.01)，并能夠上調(diào)Akt1/GSK3β信號(hào)通路的表達(dá)。帕潘立酮與MK-801共培養(yǎng)加入LY294002后，可明顯抑制帕潘立酮的神經(jīng)保護(hù)作用。體內(nèi)結(jié)果顯示，應(yīng)用MK-801可成功建立精神分裂癥小鼠動(dòng)物模型，小鼠刻板性旋轉(zhuǎn)次數(shù)及平衡木穿梭次數(shù)顯著增加，額葉皮層