骨髓源CD11b+F4-80+未成熟樹突細(xì)胞通過調(diào)節(jié)Tregs-Th17平衡發(fā)揮對小鼠CIA治療作用.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種主要累及小關(guān)節(jié)的慢性自身免疫病。促炎癥細(xì)胞與抗炎細(xì)胞及其相應(yīng)的細(xì)胞因子間失平衡參與了RA的病理過程。樹突細(xì)胞(dendritic cells,DCs)是目前公認(rèn)的體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞（antigen-presenting cell,APC),具有調(diào)控固有免疫和適應(yīng)性免疫的雙重作用。目前越來越多的證據(jù)表明DCs具有促進(jìn)耐受,調(diào)控炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞平衡的作用。D

2、Cs具有免疫原性和耐受性雙重作用,成熟樹突細(xì)胞(mature DCs,mDCs)顯示免疫原性,而未成熟樹突細(xì)胞(Immature DCs,iDCs)顯示耐受特性,iDCs促進(jìn)Tregs細(xì)胞的生成,在外周和中樞耐受中發(fā)揮重要作用。CD11b+F4/80+DCs能抑制T細(xì)胞的增生及限制促炎因子的產(chǎn)生。Th17細(xì)胞是介導(dǎo)炎性反應(yīng)和關(guān)節(jié)損害的重要效應(yīng)細(xì)胞,能分泌促炎因子IL-17,促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1和腫瘤壞死因子(tumor necros

3、is factor,TNF);而且Th17通過在關(guān)節(jié)組織釋放促炎因子和趨化因子,促進(jìn)巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生,中性粒細(xì)胞的浸潤及活化。相反,Tregs細(xì)胞是產(chǎn)生與中樞胸腺及外周組織的主要抗炎細(xì)胞,在RA病人和關(guān)節(jié)炎模型中都發(fā)現(xiàn)Tregs的功能受到損害。
　　目前治療RA的藥物主要包括非甾體類抗炎藥物、疾病調(diào)修藥和生物制劑,有較好療效,但長期使用不良反應(yīng)較多,患者難以耐受。利用細(xì)胞免疫療法治療RA,重建免疫耐受機(jī)制,已成為一個新策略,iDCs

4、調(diào)控炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞平衡的特性,為RA治療提供前景。本實驗從體外誘導(dǎo)小鼠BM CD11b+F4/80+iDC,并顯示耐受特性。那么BM CD11b+F4/80+iDC能否通過處理和呈遞抗原,調(diào)控 Tregs和Th17功能,介導(dǎo)免疫耐受發(fā)揮對CIA的治療作用;BM CD11b+F4/80+iDC又是通過怎樣的機(jī)制實現(xiàn)對 Tregs和Th17的功能調(diào)控,目前尚不清楚。本實驗從體外誘導(dǎo)分離小鼠BM CD11b+F4/80+iDC,研究BM

5、CD11b+F4/80+iDC對小鼠膠原性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis,CIA)的治療作用并進(jìn)一步探討B(tài)M CD11b+F4/80+iDC對Tregs和Th17功能的調(diào)控機(jī)制。
　　目的:明確骨髓源CD11b+F4/80+未成熟樹突細(xì)胞(BM CD11b+F4/80+iDC)對 CIA小鼠的治療作用及部分機(jī)制
　　方法:體外用 rmGM-CSF和rmIL-4誘導(dǎo) BM CD11b+F4/80+

6、iDC,并通過分析TLR-2、IDO、IL-10和TGF-β1的表達(dá)以及混合淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)(mixed leukocyte reaction,MLR)對BM CD11b+F4/80+iDC的耐受功能進(jìn)行鑒定。采用注射雞Ⅱ型膠原乳劑誘導(dǎo)小鼠CIA模型,BM CD11b+F4/80+iDC治療組在免疫后d14,d21和d28分別尾靜脈注射三次BM CD11b+F4/80+iDC。通過觀察關(guān)節(jié)炎指數(shù)、關(guān)節(jié)和脾臟病理、體重、胸腺指數(shù)、胸腺細(xì)胞

7、增殖、IL-1β、TNF-α、IL-17A、IL-10和TGF-β1水平以及Tregs和Th17細(xì)胞的比較評價BM CD11b+F4/80+iDC對CIA小鼠的治療作用。體外實驗中,通過分析BM CD11b+F4/80+iDC對Tregs和Th17細(xì)胞比例及分泌的細(xì)胞因子、Foxp3、Helios、IL-17和RORγt mRNA的表達(dá)觀察 BM CD11b+F4/80+iDC對T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。
　　采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(rever

8、se transcription PCR,RT-PCR)檢測Foxp3、Helios和IL-17 mRNA的表達(dá),實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)法檢測 RORγtmRNA的表達(dá);培養(yǎng)上清和CIA小鼠中 IL-1β、TNF-α、IL-17A、IL-10和TGF-β1水平利用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測;CD11b+

9、F4/80+iDC、Tregs和Th17細(xì)胞的百分含量采用流式細(xì)胞術(shù)檢測;IDO和CTLA-4的表達(dá)采用免疫印跡(Western-blot)法檢測;MTT法檢測胸腺細(xì)胞增殖和MLR;免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測TLR-2、IDO和CD83表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.rmGM-CSF和rmIL-4體外能夠成功誘導(dǎo)BM CD11b+F4/80+iDC并顯示耐受特性
　　1.1體外能夠成功誘導(dǎo)BM CD11b+F4/80+iDC

10、>　　采用rmGM-CSF(20μg/L)和rmIL-4(20μg/L)聯(lián)合誘導(dǎo)小鼠后肢股骨和脛骨骨髓細(xì)胞,體外成功誘導(dǎo)BM CD11b+F4/80+iDC,并且CD11b+F4/80+iDC百分含量在26.6％,采用流式細(xì)胞分選系統(tǒng)分離純化得到的細(xì)胞純度到達(dá)99%。每只小鼠能獲得大約1×106個BM CD11b+F4/80+iDC。
　　1.2 BM CD11b+F4/80+iDC呈現(xiàn)耐受表型和功能
　　rmGM-CSF和

11、rmIL-4誘導(dǎo)的BM CD11b+F4/80+iDC培養(yǎng)上清IL-10和TGF-β1水平較高,高于LPS誘導(dǎo)的mDCs培養(yǎng)上清IL-10和TGF-β1水平;CD11b+F4/80+iDC高表達(dá)TLR-2和IDO,而mDCs表達(dá)較少,并且誘導(dǎo)的CD11b+F4/80+iDC幾乎不表達(dá)CD83,而經(jīng)LPS誘導(dǎo)的mDCs高表達(dá)CD83;mDCs具有強(qiáng)烈刺激同種異體T細(xì)胞增殖的能力,而BM CD11b+F4/80+iDC則不能有效刺激同種異體

12、T細(xì)胞增殖。提示rmGM-CSF和rmIL-4誘導(dǎo)的CD11b+F4/80+iDC可通過高表達(dá)表達(dá)IDO、TLR-2、分泌IL-10和TGF-β1而顯示耐受潛能。
　　2.體外誘生的BM CD11b+F4/80+iDC對小鼠CIA的治療作用及對Tregs和Th17亞群功能的調(diào)節(jié)
　　2.1 BM CD11b+F4/80+iDC對小鼠CIA有治療作用
　　BM CD11b+F4/80+iDC治療組在首次免疫后d14,d2

13、1和d28分別注射三次BM CD11b+F4/80+iDC。CIA小鼠的腫脹高峰在d35至d42天。與正常組相比,CIA小鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯升高,BM CD11b+F4/80+iDC可明顯降低CIA小鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù);與正常組相比,CIA小鼠的滑膜炎、血管翳形成以及軟骨和骨質(zhì)侵蝕明顯,BM CD11b+F4/80+iDC治療可顯著改善各項關(guān)節(jié)病理變化,降低滑膜組織增生、炎性細(xì)胞浸潤及軟骨和骨質(zhì)侵蝕的評分。
　　CIA小鼠病理顯示脾臟

14、白髓增生,生發(fā)中心出現(xiàn),紅髓充血。與正常組相比,CIA小鼠淋巴濾泡增生,邊緣區(qū)及紅髓充血的評分顯著升高,BM CD11b+F4/80+iDC可以降低生發(fā)中心的產(chǎn)生和以上各項脾臟病理評分。
　　與正常組相比,CIA小鼠體重在d35至d46顯著降低,BM CD11b+F4/80+iDC可以明顯升高CIA小鼠的體重;d46檢測CIA小鼠的胸腺指數(shù),與正常組相比,CIA小鼠的胸腺指數(shù)明顯升高,BM CD11b+F4/80+iDC可以明顯降

15、低CIA小鼠的胸腺指數(shù)。
　　2.2 BM CD11b+F4/80+iDC抑制胸腺細(xì)胞增生
　　我們采用 ConA誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞增殖反應(yīng)進(jìn)一步研究 BM CD11b+F4/80+iDC在體內(nèi)對 T細(xì)胞的影響,結(jié)果顯示與正常組相比,CIA小鼠的胸腺細(xì)胞增殖反應(yīng)明顯升高,BM CD11b+F4/80+iDC可以明顯降低CIA小鼠的胸腺細(xì)胞增殖反應(yīng)。
　　2.3 BM CD11b+F4/80+iDC調(diào)節(jié)CIA小鼠Th17和T

16、regs的平衡
　　與正常組相比,CIA小鼠中 CD4+IL-17+Th17細(xì)胞比例升高,但CD4+CD25+FoxP3+ Tregs細(xì)胞比例明顯降低,BM CD11b+F4/80+iDC降低CD4+IL-17+Th17細(xì)胞比例,升高CD4+CD25+FoxP3+Tregs細(xì)胞比例;與正常組相比,CIA小鼠血清中 IL-17A水平升高,IL-10和TGF-β1水平降低,BM CD11b+F4/80+iDC治療的小鼠血清中IL-17

17、A水平降低,IL-10和TGF-β1水平升高;與正常組相比,CIA小鼠脾臟組織中 CTLA-4的表達(dá)明顯降低,BM CD11b+F4/80+iDC治療的小鼠脾臟組織中CTLA-4的表達(dá)明顯升高。
　　2.4 BM CD11b+F4/80+iDC降低CIA小鼠血清炎性因子水平并升高抗炎因子水平
　　與正常組相比,CIA小鼠血清IL-1β、TNF-α和IL-17A水平明顯升高,IL-10和TGF-β1水平明顯降低。BM CD11

18、b+F4/80+iDC降低血清中IL-1β、TNF-α和IL-17A表達(dá),并顯著升高血清中IL-10和TGF-β1水平;并且,與正常組相比,CIA小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清TNF-α和IL-1β水平顯著升高,BM CD11b+F4/80+iDC顯著降低巨噬細(xì)胞上清中TNF-α和IL-1β的水平。
　　3.BM CD11b+F4/80+iDC體外對Tregs和Th17分化的調(diào)節(jié)作用
　　3.1 BM CD11b+F4/80+iDC體

19、外促進(jìn)Tregs分化
　　結(jié)果顯示,在TGF-β1和OVA同時存在的條件下BM CD11b+F4/80+iDC能顯著升高共培養(yǎng)Tregs的百分含量,升高共培養(yǎng)上清IL-10的水平,促進(jìn)共培養(yǎng)T細(xì)胞表達(dá)CTLA-4,升高共培養(yǎng)T細(xì)胞Foxp3 mRNA和Helios mRNA的表達(dá)。
　　3.2 BM CD11b+F4/80+iDC體外抑制Th17細(xì)胞的功能
　　結(jié)果顯示,BM CD11b+F4/80+iDC能抑制 Co

20、nA誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖反應(yīng);在PMA,Ion和BFA存在下能降低共培養(yǎng)T細(xì)胞中Th17細(xì)胞的百分含量,降低共培養(yǎng)上清IL-17A的水平,降低共培養(yǎng)T細(xì)胞IL-17 mRNA和RORγt mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.rmGM-CSF和rmIL-4體外能夠成功誘導(dǎo)BM CD11b+F4/80+iDC,并顯示耐受特性。
　　2.BM CD11b+F4/80+iDC對小鼠CIA有治療作用。
　　3.BM CD11