IKK2dn轉(zhuǎn)染受者未成熟樹突狀細胞誘導產(chǎn)生的CD4+CD25-T細胞致耐受作用的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 通過重組腺病毒介導的IKK2dn基因轉(zhuǎn)染受者未成熟樹突狀細胞(immaturedendritic cells，imDC)，并以此誘導產(chǎn)生CD4+CD25-T細胞，進而研究CD4+CD25-T細胞對免疫反應的影響，并分析細胞因子的變化。探討轉(zhuǎn)染IKK2dn基因的受者來源imDC誘導產(chǎn)生的CD4+CD25-T細胞致免疫耐受的特性及機制，從而為應用受者來源imDC誘導免疫耐受提供新的解決思路和方法。
　　 方法：

2、
　　 本實驗分兩部分進行：第一部分，體外誘導培養(yǎng)Lewis大鼠(受者)來源的imDC，轉(zhuǎn)染IKK2dn基因維持其未成熟狀態(tài)，并以此誘導產(chǎn)生CD4+CD25-T細胞；第二部分，分選、收集CD4+CD25-T細胞，通過體外混合淋巴細胞反應(mixed lymphocyte reaction.MLR)，檢測CD4+CD25-T細胞在MLR中的致耐受作用。具體實驗方法如下：1、無菌提取大鼠(受者)雙側(cè)股骨、脛骨，獲得骨髓源性單個核細胞

3、，體外應用粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)和白介素-4(interleukin-4，IL-4)誘導大鼠骨髓源性單個核細胞分化為imDC，并于第五天收集細胞；2、分別用構(gòu)建好的空載體腺病毒(Adv-0)、IKK2dn重組腺病毒載體(Adv-IKK2dn)轉(zhuǎn)染imDC，獲得Adv0-DC及IKK2dn-DC，采用Western bl

4、otting檢測轉(zhuǎn)染基因的表達情況，后與供者大鼠(Brown Norway，BN)抗原肽共孵育；3、將獲得的轉(zhuǎn)染IKK2dn基因并負載供者抗原的imDC與受者T細胞共培養(yǎng)，并用流式細胞儀檢測CD4+CD25-T細胞的產(chǎn)生情況；4、采用免疫磁珠陰性加陽性分離法分選獲得CD4+CD25-T細胞，體外進一步擴增培養(yǎng)；5、實驗共分為陰性對照組、陽性對照組、Adv0-CD4+T細胞組(Adv0-DC誘導產(chǎn)生的T細胞)、IKK2dn-T細胞組(IK

5、K2dn-DC誘導產(chǎn)生的CD4+CD25-T細胞)。分別以供者大鼠以及第三方大鼠制備的絲裂霉素C滅活的脾細胞作為刺激細胞，受者大鼠T細胞為反應細胞，通過MTT法觀察CD4+CD25-T細胞對異體抗原刺激所引起的受者T細胞增殖反應的調(diào)節(jié)能力。ELISA法檢測細胞共培養(yǎng)后上清中IL-2、IL-10、IFN-γ及TGF-β的水平。
　　 結(jié)果：
　　 1、我們成功培養(yǎng)獲得了高濃度、純度的imDC，每只大鼠股骨和脛骨骨髓分離后計

6、數(shù)，約獲得3.0×107單個核細胞，細胞活力檢測>95％。成功培養(yǎng)的imDC呈疏松半懸浮生長，表面可見少許不規(guī)則的樹枝狀突起，體積較大，用透射電鏡觀察，細胞呈類圓形，胞漿豐富，細胞器多，細胞表面偶見少量突起，符合imDC超微結(jié)構(gòu)特征，流式細胞儀檢測細胞表型：CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表達陽性率較低，分別約為19.1±2.15％、17.0±1.60％和27.0±2.21％，與前期研究一致。培養(yǎng)第14天，CD86、MHC-Ⅱ的表達陽性

7、率明顯增加(56.0±3.40％和66.5±1.40％)，與第5天相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 2、在倒置熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染腺病毒載體后的細胞膜表面染有綠色熒光，呈明顯的不規(guī)則的毛刺樣突起。采用Western blotting檢測，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染IKK2dn后可以檢測到分子量為87kDa的條帶，證實成功轉(zhuǎn)染imDC。初次MLR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染IKK2dn并負載供者抗原的受者imDC刺激受者T細胞增殖能力低下，與負

8、載供者抗原的未轉(zhuǎn)染imDC以及轉(zhuǎn)染空載體的imDC(Adv0-DC)相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 3、受者Lewis大鼠骨髓源性imDC轉(zhuǎn)染IKK2dn基因并負載BN大鼠抗原后可以在體外刺激誘導Lewis大鼠T細胞分化產(chǎn)生CD4+CD25-T。細胞，轉(zhuǎn)染IKK2dn的imDC誘導產(chǎn)生的CD4+T細胞中低表達CD25(18.5±1.40％)，和對照組(72.2±3.30％)及Adv0-DC組相比(63.7±1.

9、80％)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 4、體外實驗證明，轉(zhuǎn)染IKK2dn并負載供者抗原受者imDC誘導產(chǎn)生的CD4+CD25-T細胞能夠抑制同種異體抗原刺激所引起的受者T細胞的增殖。當CD4+CD25-T。細胞為高比例時(CD4+CD25-T/MLR)，不僅能夠抑制供者抗原刺激引起的T細胞增殖，而且抑制第三方抗原引起的T細胞增殖(P<0.05)；當CD4+CD25-T細胞為低比例時，此種抑制作用具有抗原特異性，僅

10、對供者抗原引起的增殖反應具有抑制作用(P<0.05)。MLR上清中IL-10、TGF-β水平明顯升高(P<0.05)，IL-2、IFN-γ水平明顯下降(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、轉(zhuǎn)染IKK2dn基因并負載供者抗原的受者imDC可以誘導受者T細胞產(chǎn)生CD4+CD25-T細胞，體外實驗證實此種CD4+CD25-T細胞能夠誘導受者T細胞特異性低反應，具有誘導免疫耐受的作用。
　　 2、CD4+CD25-

11、T細胞誘導的免疫抑制功能具有供者抗原特異性，此種特異性與CD4+CD25-T細胞所占比例有關，其作用機理與分泌高水平的細胞因子IL-10、TGF-β，抑制T細胞向效應性T細胞方向分化有關。
　　 3、體外應用低劑量細胞因子IL-4(5ng/ml)和GM-CSF(5ng/ml)可以高效的誘導培養(yǎng)足夠數(shù)量及純度的未成熟樹突狀細胞，為DC誘導免疫耐受提供了可能。
　　 4、Adv-IKK2dn轉(zhuǎn)染受者imDC能夠維持其未成熟狀