Foxp3基因轉(zhuǎn)染的CD4+CD25-T細(xì)胞對小鼠心臟移植物存活的影響.pdf

1、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞因具有強(qiáng)大的免疫抑制能力在器官移植領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注，可能成為誘導(dǎo)器官移植后免疫耐受的有效手段之一，但由于可應(yīng)用的細(xì)胞數(shù)量過少限制了其臨床應(yīng)用。模擬體內(nèi)條件對其進(jìn)行的體外擴(kuò)增取得了一定的成果，但這種方法耗時長，費(fèi)用昂貴，實驗條件要求高而無法推廣。Foxp3的發(fā)現(xiàn)為我們提供了另外一種選擇，利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將Foxp3基因?qū)隒D4+CD25-T淋巴細(xì)胞，能夠使其獲得與自然發(fā)生的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

2、相似的細(xì)胞表型，以及與之相當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)能力，使得獲得足夠的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞成為一種可能。 目的： 通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN介導(dǎo)小鼠Foxp3基因進(jìn)入小鼠CD4+CD25-T細(xì)胞，使其轉(zhuǎn)化為具有免疫抑制能力的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。研究此細(xì)胞體外抑制自身淋巴細(xì)胞增殖的能力，體內(nèi)對小鼠異位心臟移植物存活的影響。 方法： 1.利用原始質(zhì)粒pMD18-T-Foxp3構(gòu)建Foxp3逆轉(zhuǎn)錄病毒體系pLXSN-Foxp3-IRES2

3、-EGFP，以PA317為包裝細(xì)胞生產(chǎn)病毒上清，感染來自C57BL/6小鼠脾臟的CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞，將Foxp3基因及報告基因EGFP同時引入靶細(xì)胞，通過觀察EGFP的表達(dá)及流式細(xì)胞儀檢測評價轉(zhuǎn)染效率。 2.將小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、轉(zhuǎn)染Foxp3基因的CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞分別與同系小鼠脾臟分離得到的單個核細(xì)胞在CD3、CD28單克隆抗體、mIL-2存在的情況下進(jìn)行混合培養(yǎng)，72小時后加入3H-Td

4、R，繼續(xù)培養(yǎng)18小時，測定cpm值，通過與空白對照組相比判斷培養(yǎng)體系的增殖程度。 3.建立小鼠器官移植模型：將Chen-z-h的小鼠頸部異位心臟移植模型術(shù)式進(jìn)一步改進(jìn)，以BALB/c小鼠為供體，C57BL/6小鼠為受體建立穩(wěn)定可靠的小鼠異位心臟移植模型，為研究實體器官移植后排斥反應(yīng)建立動物模型。 4.將小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、轉(zhuǎn)染Foxp3基因的CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞分別于術(shù)前一天輸入受體小鼠(C57B

5、L/6小鼠)體內(nèi)，同過觀察異位心臟移植物的病理表現(xiàn)、存活時間評價二者對小鼠異位心臟移植物存活的影響。 結(jié)果： 1.通過CD4+CD25+RegulatoryTCellIsolationKit，平均每只C57BL/6小鼠脾臟可分離出1.25×107個單個核細(xì)胞，進(jìn)一步分離可獲得1.12×106個CD4+CD25+T細(xì)胞和5.2×106個CD4+CD25-T細(xì)胞。分離完成后以胎盼蘭染色，倒置顯微鏡下觀察見分離所得的T淋巴細(xì)胞

6、活性良好，存活率在95％以上。 2.原始質(zhì)粒pMD18-T-Foxp3由賀偉峰博士、肖亞碩士在前期實驗中構(gòu)建，我們利用該質(zhì)粒成功的構(gòu)建了Foxp3的逆轉(zhuǎn)錄病毒體系pLXSN-Foxp3-IRES2-EGFP，通過包裝細(xì)胞PA317細(xì)胞，可生產(chǎn)滴度為4.2×104cfu/ml的病毒上清，感染CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞48小時后可以觀察到靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)明亮的綠色熒光蛋，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，感染48小時后靶細(xì)胞的CD4分子、EGFP共表

7、達(dá)比例為47.8％。 3.在淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)檢測中，F(xiàn)oxp3組結(jié)果平均為2884.89cpm，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞組平均為2560.72cpm，經(jīng)單因素方差分析二者無顯著性差異(p＞0.05)。而空白對照組平均為13319.44cpm，經(jīng)單因素方差分析，與Foxp3組、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞組均有限著差異(p＜0.01)。 4.通過提高顯微外科操作技術(shù)，改進(jìn)血管吻合方法，完善試驗條件，我們成功建立了以BALB/c小鼠為供體，C57BL/

8、6小鼠為受體建立的小鼠頸部異位心臟移植模型，手術(shù)成功率可達(dá)95％。 5.異位心臟移植術(shù)后第7天病理學(xué)檢查：空白對照組異位心臟移植物可見大量淋巴細(xì)胞浸潤，組織充血水腫，甚至表現(xiàn)為廣泛的心肌變性、壞死。Foxp3組、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞組病理表現(xiàn)相似，表現(xiàn)為心臟組織內(nèi)局灶性血管周圍和心肌間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤，心肌輕度水腫或局灶性心肌損傷，炎癥反應(yīng)明顯輕于空白對照組。 6.異位心臟移植物存活時間的觀察可見Foxp3組異位心臟移植物存活時間

9、平均為60.2天，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞組異位心臟移植物平均存活時間62.6天，經(jīng)單因素方差分析二組之間無顯著差異(p＞0.05)，空白對照組異位心臟移植物平均存活時間為11.5天，與Foxp3組、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞組之間均存在顯著差異(p＜0.01)。 結(jié)論： 1.本實驗證實利用原始質(zhì)粒pMD18-T-Foxp3能夠成功構(gòu)建Foxp3的逆轉(zhuǎn)錄病毒體系pLXSN-Foxp3-IRES2-EGFP，以PA317細(xì)胞為包裝細(xì)胞，可以生產(chǎn)滴度

10、為4.2×104cfu/ml的病毒上清。 2.利用CD4+CD25+RegulatoryTCellIsolationKit能夠在小鼠脾臟單個核細(xì)胞中分離出高純度的CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞和CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞。以PA317/pLXSN-Foxp3-IRES2-EGFP病毒上清感染C57BL/6小鼠naiveCD4+CD25-T淋巴細(xì)胞可以47.8％的效率將Foxp3基因?qū)胄∈蟀屑?xì)胞。 3.轉(zhuǎn)染Foxp3基因

11、的CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞在體外能夠顯著抑制以CD3、CD28單克隆抗體刺激的同系小鼠的淋巴細(xì)胞增殖，其抑制淋巴細(xì)胞增殖的能力與自然發(fā)生的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能力相當(dāng)。 4.小鼠遺傳背景清晰，可實現(xiàn)嚴(yán)格的免疫學(xué)對照，是在移植免疫研究中經(jīng)常使用的實驗動物，小鼠頸部異位心臟移植操作簡單，方法易于掌握，我們在實驗中成功建立了小鼠頸部異位心臟移植模型，證實小鼠頸部異位心臟移植模型是一種穩(wěn)定、可靠、易于推廣的器官移植模型。