小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞局部注射對硬皮病小鼠模型局部皮損和轉(zhuǎn)化生長因子-β1影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:硬皮病是一種以彌漫性微血管病變伴皮膚和內(nèi)臟器官纖維硬化為特征的自身免疫性結(jié)締組織病。病變僅局限于皮膚者稱為局限性硬皮病（又稱為硬斑?。?，累積系統(tǒng)者稱為系統(tǒng)性硬皮病。硬皮病的病因和發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，涉及一系列細(xì)胞、細(xì)胞因子、趨化因子的變化，目前仍不明確，膠原合成過多，分解減少，大量膠原纖維沉積在皮膚、肺等組織器官是其主要病理過程之一。近年來國內(nèi)外學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)在硬皮病纖維硬化的形成和發(fā)展過程中起重要作用

2、。研究TGF-β1與硬皮病發(fā)病的關(guān)系，可以為闡明硬皮病的發(fā)病機(jī)制提供部分理論依據(jù)，對硬皮病的治療提供重要指導(dǎo)。由于硬皮病的病因和發(fā)病機(jī)制不明，因此尚無確切有效的治療方法，目前主要是使用免疫抑制劑、抗纖維化和血管活性藥物等對癥治療，但其副作用大療效較差。隨著近年來對干細(xì)胞研究的深入，其在醫(yī)學(xué)頑疾治療領(lǐng)域取得了令人矚目的成績，而間充質(zhì)干細(xì)胞作為這一家族的新發(fā)現(xiàn)成員，具有強(qiáng)大的增殖能力、免疫調(diào)節(jié)功能和低免疫原性等特征，臨床應(yīng)用優(yōu)勢明顯。目前已

3、有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)可通過間充質(zhì)干細(xì)胞的局部注射或系統(tǒng)輸注，而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)作用。本實(shí)驗(yàn)擬通過成功建立硬皮病小鼠模型，局部皮下注射小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞(mdMSCs)，通過比較注射組和對照組局部皮損外觀變化、膠原纖維染色變化和真皮厚度來觀察間充質(zhì)干細(xì)胞對局部皮損的治療作用，并通過檢測注射前后局部皮損TGF-β1的表達(dá)定量來探討其中的可能機(jī)制，從而為硬皮病局部皮損的臨床治療提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1取出生1天的

4、BALB/c雄性小鼠皮膚組織進(jìn)行胰酶消化，培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，并傳代培養(yǎng)。
　　2通過觀察培養(yǎng)得到的細(xì)胞形態(tài)、使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期和表面標(biāo)志物CD44、CD29的測定來對小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　3使用PKH26標(biāo)記小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞，并觀察染色對細(xì)胞生長和增殖的影響。
　　4硬皮病動(dòng)物模型的建立:將24只SPF級雌性6周齡BALB/c小鼠隨機(jī)分為A、B、C三組，A組（11只）、B組（11只）為博萊霉素注射

5、組，C組（2只）為PBS注射組。使用500μg/mL博來霉素稀釋液0.1mL皮下注射入A、B兩組小鼠背部，PBS注射液0.1mL皮下注射入C組小鼠背部，每日1次連續(xù)3周觀察局部皮損外觀變化，第3周末分別隨機(jī)斷頸處死各組中的2只小鼠取局部皮膚活檢，證實(shí)造模成功。
　　5將PKH26標(biāo)記的小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞密度調(diào)至5×106/0.25mL，皮下注射入A組各小鼠背部皮損區(qū)，0.25mL/只。B組各小鼠背部皮損區(qū)皮下注射PBS液，

6、0.25mL/只。讓小鼠自由進(jìn)食水，觀察并記錄兩組小鼠的狀態(tài)和局部皮損變化。
　　63周后，將兩組小鼠全部斷頸處死，切取各小鼠背部皮損區(qū)皮膚行組織固定，石蠟包埋，分別行HE染色、苦味酸-酸性品紅膠原纖維染色和TGF-β1免疫組織化學(xué)SP法染色。在熒光顯微鏡下觀察mdMSCs在A組小鼠局部皮膚內(nèi)的分布。應(yīng)用醫(yī)學(xué)彩色病理圖像分析系統(tǒng)測量兩組小鼠的真皮厚度，采用多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)對切片中TGF-β1的相對含量進(jìn)行定量分析，

7、計(jì)算TGF-β1的免疫組化評分。
　　7運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　1使用胰酶消化、培養(yǎng)貼壁細(xì)胞方法分離純化細(xì)胞，可逐步得到成纖維細(xì)胞形態(tài)樣的間充質(zhì)干細(xì)胞。所得到的間充質(zhì)干細(xì)胞大部分細(xì)胞處于靜止期(G(O)/G1期:83.02％)，只有少部分處于分裂期(G2/S期:16.98％，其中G2/G1期:1.95％)。第3代小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞中表面標(biāo)志物CD44+，CD29+雙陽性的細(xì)胞約

8、為90％。
　　2 PKH26標(biāo)記的小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞胞膜均勻紅染，細(xì)胞體積大小、密度與光鏡下基本一致，子代也有熒光。熒光染料未對干細(xì)胞的生長和增殖產(chǎn)生明顯影響。
　　33周后博來霉素注射組小鼠背部注射區(qū)域皮膚硬化增厚明顯，未見毛發(fā)生長，彈性差。PBS對照組小鼠背部注射區(qū)皮膚未見明顯變化。組織切片HE、苦味酸-酸性品紅染色結(jié)果示造模組比對照組注射區(qū)真皮層明顯增厚，膠原纖維明顯增多，增粗，密集分布甚至融合成片，排列紊亂，均質(zhì)

9、化，真皮中下部血管管壁增厚，脂肪層變薄，局部炎細(xì)胞浸潤。TGF-β1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果示TGF-β1在對照組表皮和真皮層呈灶狀弱陽性表達(dá)，在造模組的表皮棘層、基底層、真皮層及毛囊均呈強(qiáng)陽性表達(dá)。從而成功誘導(dǎo)出局限性硬皮病小鼠模型。
　　4 PKH26標(biāo)記的小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞皮下注射3周后，熒光顯微鏡下觀察可見干細(xì)胞分布于真皮層和皮下組織。
　　5 mdMSCs5×106皮下注射3周后兩組小鼠均存活，實(shí)驗(yàn)組（A組）小鼠背部

10、注射區(qū)皮膚較前軟化，彈性部分恢復(fù)。對照組（B組）小鼠背部皮損較前無明顯變化。實(shí)驗(yàn)組HE染色、苦味酸-酸性品紅染色組織切片示膠原纖維較前變細(xì)，數(shù)量減少，真皮層變薄，局部毛細(xì)血管增生。對照組組織學(xué)表現(xiàn)較前未見明顯變化。實(shí)驗(yàn)組真皮厚度較對照組顯著變薄，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　6 TGF-β1免疫組織化學(xué)SP法染色結(jié)果示TGF-β1在實(shí)驗(yàn)組和對照組的表皮棘層、基底層、真皮層及毛囊均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，TGF-β1在實(shí)驗(yàn)組和對照組的表

11、達(dá)定量（免疫組化評分）無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1使用博來霉素500μg/mL連續(xù)皮下注射BALB/c小鼠背部，1次/日，0.1ml/次，3周后可成功建立具有局部皮膚損害的硬皮病小鼠動(dòng)物模型。
　　2小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞局部皮下注射可有效改善硬皮病小鼠模型局部皮損的硬化程度和膠原含量，但這一治療作用可能并不是通過小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞對皮損局部TGF-β1的調(diào)控而實(shí)現(xiàn)的，至少不是通過對TGF-β1單一調(diào)