肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子修飾的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)再障模型小鼠造血功能的影響.pdf

1、再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是一種常見的骨髓衰竭癥，其病因多樣、發(fā)病機(jī)理復(fù)雜。造血微環(huán)境缺陷是導(dǎo)致再生障礙性貧血發(fā)病的機(jī)制之一。尤其是骨髓基質(zhì)細(xì)胞之一的間充質(zhì)干細(xì)胞的缺陷很可能是導(dǎo)致再生障礙性貧血發(fā)生的重要環(huán)節(jié)之一;再生障礙性貧血的治療除雄激素、免疫抑制劑以外，造血干細(xì)胞移植是非常重要的手段，但供體細(xì)胞來源的不足和嚴(yán)重的移植物抗宿主病(GVHD)是阻礙這種技術(shù)開展的重要障礙。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal

2、stem cell，MSC)的特點(diǎn)為該類細(xì)胞共有的自我更新、復(fù)制能力以及多向分化潛能，可進(jìn)一步分化為造血細(xì)胞，并且可以支持造血、調(diào)節(jié)免疫功能，是骨髓造血微環(huán)境的重要組成成分。間充質(zhì)干細(xì)胞具有低的免疫原性和可移植性，正在逐步成為細(xì)胞治療的重要種子細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞共移植可以促進(jìn)造血干細(xì)胞植入、減少GVHD的發(fā)生。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growthfactor，HGF)作為一種細(xì)胞因子具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)作用，同時(shí)對(duì)

3、血管生成、細(xì)胞分裂等均有影響，還可以對(duì)造血干、祖細(xì)胞向造血部位（骨髓）遷移起著促進(jìn)和誘導(dǎo)的作用。表達(dá)HGF的相關(guān)基因可以通過腺病毒等載體轉(zhuǎn)染入間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)，使間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)HGF增多，多數(shù)的研究表明HGF基因的修飾對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)、調(diào)節(jié)免疫等方面功能有增強(qiáng)的作用。但HGF基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)造血功能的影響方面的研究卻比較少。
　　目的:本研究的目的是在我院前期臨床經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)

4、胞(Human umbilical cord derived mesenchymal stem cells，hUMSC)對(duì)再障模型小鼠造血功能的影響、HGF和間充質(zhì)干細(xì)胞在對(duì)再障模型小鼠造血功能的影響上是否有協(xié)同作用，HGF基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞系的構(gòu)建和其在再生障礙性貧血臨床治療中的潛在的價(jià)值。
　　方法:
　　第一部分:回顧性分析新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科2009年1月至2014年12月重型再生障礙性貧血(SAA)接受

5、人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合外周血干細(xì)胞共移植病例6例，其中SAAⅠ型2例，SAAⅡ型4例，移植前均接受環(huán)孢菌素(CSA)及雄性激素治療并不同數(shù)量輸血，供者均為HLA配型6/6全相合同胞，其中男性供者4例，女性供者2例，血型不合1例。預(yù)處理方案為經(jīng)典“環(huán)磷酰胺+ATG”的基礎(chǔ)上加氟達(dá)拉濱;短療程氨甲蝶呤(MTX)加環(huán)孢菌素預(yù)防GVHD;患者住無菌的移植病房;注意加強(qiáng)支持治療。0天輸注外周血干細(xì)胞CD34+細(xì)胞4.18(2.75-6.46)

6、×106/kg(患者)輸注造血干細(xì)胞前4小時(shí)輸注人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞2.71(2.4-3.0)×1010個(gè)。觀察預(yù)處理方案不良反應(yīng)，輸注造血干細(xì)胞過及間充質(zhì)干細(xì)胞過程是否是順利;造血功能恢復(fù)時(shí)間的觀察;GVHD及其他并發(fā)癥發(fā)生的情況以及供者干細(xì)胞植入情況。
　　第二部分:我們通過貼壁培養(yǎng)法，獲得人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(humanumbilical cord mesenchymal stem cells、hUMSC)，通過流式

7、細(xì)胞儀檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原標(biāo)志、通過誘導(dǎo)成神經(jīng)細(xì)胞分化和成脂肪分化來鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。
　　應(yīng)用攜帶HGF基因的腺病毒載體(Ad-HGF)轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞，MOI為150 pfu/細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)間48小時(shí)。應(yīng)用免疫標(biāo)記法(Western blot)及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞HGF的表達(dá)。
　　同時(shí)通過流式細(xì)胞儀對(duì)表面標(biāo)志進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)，應(yīng)用成神經(jīng)細(xì)胞和成脂肪分化過程來檢測(cè)Ad-H

8、GF轉(zhuǎn)染對(duì)人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞的影響。
　　第三部分:我們將24只BABL/C小鼠分為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、hUMSC組、Ad-HGF修飾MSC組，應(yīng)用6MV的X線均勻照射各組小鼠，照射后第2、4、6天，給每只小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg、氯霉素62.5mg/kg。造模后第8天MSC組經(jīng)小鼠尾靜脈給hUMSC懸液注射含細(xì)胞數(shù)5×107個(gè)、Ad-HGF修飾MSC組經(jīng)小鼠尾靜脈注射Ad-HGF修飾的MSC懸液0.2ml含細(xì)胞數(shù)5×107

9、個(gè)，并于注射后第2天應(yīng)用ELISA法檢測(cè)模型小鼠外周血中HGF的含量。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組等量注射生理鹽水。造模后每天觀察小鼠一般情況同時(shí)測(cè)量體重等指標(biāo)。造模后第8天取血觀察三組血常規(guī)變化、同時(shí)取骨髓行骨髓涂片、骨髓活檢的檢查;瀕死小鼠及死亡小鼠解剖觀察;觀察造模后第21天血常規(guī)，評(píng)價(jià)小鼠再障模型的穩(wěn)定性及3組小鼠造血功能變化及恢復(fù)的程度。三組數(shù)據(jù)對(duì)比采用統(tǒng)計(jì)學(xué)T檢驗(yàn)方法。
　　結(jié)果:
　　第一部分:6例患者均順利植入，3個(gè)月時(shí)評(píng)價(jià)均

10、為100％供者型，白細(xì)胞中位恢復(fù)時(shí)間12d，血小板中位恢復(fù)時(shí)間16d。移植過程順利，人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞輸注過程中患者無不良反應(yīng)，無急性移植物抗宿主病(GVHD)發(fā)生，無其他嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生。
　　第二部分:我們通過貼壁培養(yǎng)法獲得的獲得人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞均呈貼壁生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，表型特征分析顯示細(xì)胞為非造血細(xì)胞群，轉(zhuǎn)化試驗(yàn)證明細(xì)胞具有體外成神經(jīng)細(xì)胞和成脂肪能力，說明獲得的細(xì)胞符合MSC的特性。
　　我們應(yīng)用攜帶

11、HGF基因的腺病毒載體(Ad-HGF)轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞，通過檢測(cè)其表面標(biāo)志及分化能力均不受影響。通免疫印跡法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)的轉(zhuǎn)染后間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)的較未轉(zhuǎn)染組HGF增高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　第三部分:3組試驗(yàn)小鼠應(yīng)用X線及化學(xué)藥物造模，在造模后發(fā)現(xiàn)小鼠活動(dòng)減少，攝食減少、體重下降，試驗(yàn)對(duì)照組1例死亡。造模后第8天，血常規(guī)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，注射間充質(zhì)干細(xì)胞2組小鼠白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板下降均較實(shí)驗(yàn)對(duì)照組輕，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Ad-

12、HGF轉(zhuǎn)染MSC組較MSC組上述指標(biāo)高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。骨髓涂片及骨髓活檢均見造血組織減少、脂肪細(xì)胞增多現(xiàn)象。但Ad-HGF轉(zhuǎn)染MSC組及MSC組病理變化較實(shí)驗(yàn)組輕。觀察至21天各組白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板數(shù)量均處于低水平，但MSC組和Ad-HGF修飾MSC組恢復(fù)較好。
　　結(jié)論:
　　第一部分:人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合外周血干細(xì)胞共移植治療重型再生障礙性貧血安全無相關(guān)不良反應(yīng)，造血恢復(fù)良好，急性GVHD發(fā)生率低。

13、　　第二部分:貼壁培養(yǎng)方法獲得的人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)檢驗(yàn)符合MSC的各項(xiàng)特征;攜帶HGF基因的腺病毒載體(Ad-HGF)轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞表面的各種標(biāo)志的表達(dá)、轉(zhuǎn)化成其他細(xì)胞的功能等特征不受影響。
　　第三部分:X線及環(huán)磷酰胺、氯霉素聯(lián)合構(gòu)建小鼠再生障礙性貧血模型符合臨床再障特點(diǎn)，血常規(guī)及骨髓變化符合典型再障表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率低。模型穩(wěn)定持久。
　　人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞及Ad-HGF修飾的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)再障模型