不同分化狀態(tài)的間充質(zhì)干細胞向肝細胞生長因子的趨化性遷移研究.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，具有擴散和浸潤的特性，即使經(jīng)過外科手術切除，并輔以放療或化療，也難以徹底治愈。因此，需要新的治療方法來追蹤逃離常規(guī)治療的散在瘤細胞。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有多向分化潛能的成體干細胞，而且能夠趨向膠質(zhì)瘤及多種趨化因子遷移，從而成為治療膠質(zhì)瘤的理想載體細胞。然而MSCs定向遷移的機制還不是完全清楚，尤其是MSCs分化狀態(tài)與遷移之間關系的研究還未見報道。本實

2、驗旨在研究不同分化狀態(tài)的骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)的趨化性遷移。
　　 本研究首先采用PercoⅡ密度梯度離心法從大鼠骨髓中分離出BMSCs，體外擴增培養(yǎng)，通過觀察細胞形態(tài)、生長特性，免疫熒光染色，成骨、成脂誘導分化，對BMSCs進行鑒定。結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)的BMSCs為長梭形，增

3、殖速度快，表面抗原CD29、CD90、CD106呈陽性，CD34、CD45為陰性，并且體外能夠誘導分化為成骨細胞及脂肪細胞，證明分離培養(yǎng)的細胞是具有多向分化潛能的BMSCs。
　　 隨后通過丁羥基茴香醚(butyl hydroxy anisol，BHA)聯(lián)合堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)誘導BMSCs成神經(jīng)分化，即先用10ng/mlbFGF預誘導24 h，再用200μ

4、M BHA和2％DMSO誘導5 h，最后用含有N2的H-DMEM維持培養(yǎng)。觀察該過程中細胞的形態(tài)變化，免疫細胞化學染色檢測神經(jīng)細胞特異性標志物nestin、β-Ⅲ-tubulin及NSE的表達變化。結(jié)果顯示，未分化BMSCs呈成纖維細胞樣；預誘導24 h后，胞體稍有收縮，邊緣變得不齊整：誘導5 h，胞體收縮成圓形或橢圓形，折光性強，有突起伸出；維持培養(yǎng)18 h后，細胞出現(xiàn)3個或更多突起；維持培養(yǎng)48 h，細胞突起更為復雜，出現(xiàn)二級分叉，

5、突起長度增加，與其他細胞的突起相互接觸。免疫熒光染色顯示，nestin與β-Ⅲ-tubulin的表達都呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢，均在誘導5 h時達到最高值，之后顯著下降；而NSE陽性細胞比率在誘導期以及維持前期都很低，到維持48 h顯著升高；GFAP在整個誘導分化過程中始終為陰性。
　　 接著運用Dunn chamber裝置研究了BMSCs及成神經(jīng)分化不同狀態(tài)BMSCs向HGF的趨化性遷移，計算細胞遷移速率和遷移效率。結(jié)果顯示，

6、在趨化性遷移實驗中，即外槽加入不同濃度HGF、內(nèi)槽只加L-DMEM時，細胞的遷移速率沒有變化，遷移效率隨著HGF濃度的增加而增高；與對照組(內(nèi)外槽均只加入L-DMEM)相比，50 ng/ml及100 ng/ml HGF均顯著提高了細胞的遷移效率，但兩者之間沒有差異。當內(nèi)外槽均加入50 ng/ml HGF，細胞的遷移速率及遷移效率與對照相比無差異，表明HGF能夠誘導BMSCs定向遷移。接著我們研究了成神經(jīng)分化的BMSCs向HGF的趨化性遷

7、移，結(jié)果顯示外槽加入50 ng/ml HGF未能改變分化各點細胞的遷移速率，但顯著提高了未分化、預誘導24 h、誘導5 h及維持48 h細胞的遷移效率，表明成神經(jīng)分化的BMSCs向HGF的趨化遷移能力與其分化狀態(tài)密切相關。用P13K抑制劑LY294002(30μM)預處理1 h的BMSCs進行趨化遷移實驗，外槽加入HGF后，細胞遷移效率與未處理組細胞相比顯著降低，即LY294002阻斷了HGF誘導BMSCs的定向遷移，證明P13K信號通

8、路參與介導HGF誘導BMSCs的定向遷移過程。
　　 最后，通過改變Racl的表達水平，觀察BMSCs隨機遷移行為及HGF誘導的定向遷移行為的變化。發(fā)現(xiàn)Racl過表達后，BMSCs遷移速率及趨向HGF的遷移效率顯著提高；干擾Racl表達后，遷移速率及趨向HGF的遷移效率顯著降低。結(jié)果表明Racl調(diào)節(jié)BMSCs的遷移速率，并且參與介導HGF誘導BMSCs的定向遷移過程。
　　 以上結(jié)果表明，HGF能夠趨化BMSCs的定向遷