家雞OC-116Z的抗體制備及晶體培養(yǎng).pdf

1、禽類蛋殼是鳥類在進(jìn)化過程中形成的,對(duì)后代的繁衍有著保護(hù)作用,對(duì)孵化幼雞也有著重要的意義。OC-116(卵功能蛋白)是由子宮合成并分泌的一種基質(zhì)蛋白,主要存在于蛋清和蛋殼的殼膜以及柵欄層中。研究表明OC-116蛋白中間肽段有形成β-折疊的趨勢(shì),而這種折疊結(jié)構(gòu)間接地控制晶體成核方向和方解石與磷酸鈣生長以及磷蛋白與羥基磷灰石結(jié)晶的互作等。而目前關(guān)于OC-116蛋白的物理結(jié)構(gòu)及功能還尚不清楚。
　　本實(shí)驗(yàn)依據(jù)原雞OC-116基因序列克隆仙

2、居雞OC-116全長編碼基因并構(gòu)建了OC-116蛋白相應(yīng)的原核表達(dá)載體。對(duì)OC-116的中間段(即OC-116Z)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并純化獲得重組蛋白、制備其多克隆抗體;此外,還進(jìn)一步探索了OC-116Z蛋白的穩(wěn)定性、聚合情況等理化性質(zhì),為后續(xù)研究OC-116蛋白的結(jié)構(gòu)及功能奠定基礎(chǔ)。
　　主要結(jié)果如下:
　　1.參照原雞(Gallus. gallus)OC-116編碼基因序列并依據(jù)功能區(qū)域設(shè)計(jì)3對(duì)引物,分段克隆了3個(gè)基因片段;測(cè)

3、序正確后通過酶切連接最終拼接得到OC-116全長編碼基因;并構(gòu)建了相應(yīng)的原核表達(dá)載體,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)現(xiàn)OC-116的N端(OC-116N)基本無表達(dá),中段肽段(OC-116Z)得到可溶性融合蛋白, OC-116的C端(OC-116C)則是部分可溶。
　　2. OC-116Z載體的原核表達(dá)及相應(yīng)蛋白純化體系的建立:經(jīng)優(yōu)化后選擇Rosetta為宿主表達(dá)菌株,用0.2 mM IPTG,20℃誘導(dǎo)13 h得到了可溶性表達(dá)產(chǎn)物;其純化過程經(jīng)優(yōu)

4、化最終選擇20 mM和40 mM咪唑作為Wash Buffer,100 mM咪唑作為Elution Buffer,通過Ni-NTA柱純化獲得純度較高的蛋白質(zhì),其濃度為3 mg/ml。
　　3.抗體制備及檢測(cè):將純化好的OC-116Z蛋白送于中科院遺傳發(fā)育所,免疫兔子制備多克隆抗體,并通過 Western-blot檢測(cè)其效價(jià)和特異性。Western所用抗體的稀釋比例為1:1000,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示條帶單一,說明抗體的特異性很好。

5、　　4.主要功能區(qū)OC-116Z蛋白的穩(wěn)定性與功能域(domain)的鑒定:通過蛋白穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),OC-116Z蛋白在室溫下是很穩(wěn)定的;胰凝乳膠蛋白酶的酶切實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在OC-116Z蛋白中存在兩個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的domain。
　　5. OC-116Z聚合性質(zhì)的鑒定:依據(jù)分子篩層析峰圖分析得出OC-116Z蛋白可具有多聚性,進(jìn)一步的戊二醛交聯(lián)試驗(yàn)結(jié)果表明 OC-116Z蛋白主要以三聚體和四聚體的形式存在。
　　6.通過懸滴法

6、進(jìn)行體外晶體培養(yǎng)篩選 OC-116Z蛋白結(jié)晶條件為 pH=4.6的0.02M Calcium chloride dihydrate,0.1M Sodium acetate trihydrate,30％ v/v(+/-)-2-Methyl-2,4-pentanediol和pH=4.6的14%(v/v)2-propanol,0.07 M Sodium acetate,0.14 M Calcium chloride,30%(v/v) Glyc