炎癥因子對細胞膽固醇攝取與合成反饋調(diào)節(jié)組織特異性的改變：泡沫細胞形成的潛在新機制.pdf

1、目的:細胞內(nèi)的膽固醇無論是外源性攝入還是內(nèi)源性合成，均通過一個依賴于胞內(nèi)膽固醇水平的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)的嚴密控制來保證膽固醇的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡，即主要通過SCAP-SREBPs-LDLr/HMGcoA reductase蛋白之間的相互作用實現(xiàn)對細胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)。過去的研究中，我們已經(jīng)證實炎性因子可以通過干擾膽固醇介導(dǎo)的低密度脂蛋白受體(LDLr)反饋調(diào)節(jié)來促進外周細胞，如腎系膜細胞(HMCs)、血管平滑肌細胞(VSMC)的膽固醇攝入，以及抑

2、制ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ABCA1)基因的表達來減少膽固醇外流從而導(dǎo)致膽固醇在外周細胞異常積聚形成泡沫細胞。 本研究在我們過去研究的基礎(chǔ)上，進一步選用HMCs和HepG2兩種細胞系，(1)探討在正常生理(非炎癥)及炎癥狀態(tài)下外周細胞和肝細胞LDLr反饋調(diào)節(jié)的組織特異性差異；(2)觀察炎癥因子是否影響人HMCs和HepG2細胞中HMGCoA還原酶(HMGCoA reductase)介導(dǎo)的內(nèi)源性膽固醇生物合成；同時探討炎癥反應(yīng)導(dǎo)致

3、細胞/機體對他汀類降脂藥物(HMGCoA還原酶活性抑制劑)抵抗的機制。(3)進一步觀察炎癥因子對LDLr/HMGCoA還原酶的上游調(diào)控蛋白——核轉(zhuǎn)錄因子SREBP-2和膽固醇敏感器SCAP的影響，探討外周細胞HMCs和肝細胞HepG2膽固醇攝入與合成組織特異性差異的分子機制。 材料和方法:用酶學(xué)方法分別檢測HMCs和HepG2細胞內(nèi)總膽固醇(TC)，游離膽固醇(FC)和膽固醇酯(CE)的水平；油紅O染色觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚情況；用

4、<'14>C標記的acetate(乙酸鹽，膽固醇合成原料、)孵育細胞，提取膽固醇，用液體閃爍計數(shù)儀測定<'14>C含量，從而測定細胞膽固醇的合成；提取細胞總RNA，應(yīng)用real-time定量PCR技術(shù)分別檢測兩種細胞LDLr、HMGCoA還原酶、SREBP-2和SCAP mRNA水平；用Western blotting檢測LDLr、HMGCoA還原酶蛋白表達水平；進一步應(yīng)用薄層層析技術(shù)測定HMGcoA還原酶活性；抗人SCAP抗體和抗高爾

5、基抗體雙重染色后，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察兩種細胞SCAP-SREBP 復(fù)合物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的定位。 結(jié)果: 1．炎性因子IL-1β能明顯促進外周細胞和肝細胞膽固醇的外源性攝入和內(nèi)源性合成，從而造成膽固醇(特別是膽固醇酯)在細胞內(nèi)異常積聚。外周細胞HMCs較肝細胞HepG2對炎癥因子更敏感。 2．正常生理(非炎癥)狀態(tài)下，當細胞加載不同濃度低密度脂蛋白(LDL)時，可以反饋抑制兩種細胞的LDLr mRNA、蛋

6、白水平，其中HMCs細胞LDLr的下調(diào)比HepG2更敏感(“下調(diào)易感”)。此外，Compactin(一種他汀類降脂藥物，HMGCoA還原酶活性抑制劑)可以通過降低細胞內(nèi)膽固醇水平，促進兩種細胞LDLr mRNA和蛋白的表達，從而增強LDLr介導(dǎo)的外源膽固醇攝入，HepG2細胞中LDLr的上調(diào)比HMCs細胞更敏感(“上調(diào)易感”)。然而，炎癥狀態(tài)下，IL-1β能干擾LDL對LDLr的下調(diào)作用，促進兩種細胞，尤其是HMCs細胞的LDLr mR

7、NA和蛋白表達，使外周細胞像肝細胞一樣，能大量攝取膽固醇。同時，當有炎性因子存在時，IL-1β能干擾Compactin對LDLr的上調(diào)作用，需要增加Compactin的劑量才能達到非炎癥狀態(tài)時同等的對LDLr上調(diào)效果。 3．正常生理(非炎癥)狀態(tài)下，加載LDL可以反饋抑制兩種細胞的HMGCoA還原酶mRNA、蛋白表達以及酶活性，這種由于胞內(nèi)膽固醇水平升高而導(dǎo)致的反饋抑制作用，HMCs比HepG2細胞更敏感。然而，炎癥狀態(tài)下，炎性

8、因子IL-1β可以打破由胞內(nèi)膽固醇介導(dǎo)這種反饋調(diào)節(jié)，在HMCs細胞，炎性因子干擾HMGCoA還原酶反饋調(diào)節(jié)主要是通過增加HMGCoA還原酶mRNA、蛋白表達及酶活性水平來實現(xiàn)，而在HepG2細胞僅僅只增加HMGCoA還原酶的酶活性水平，對mRNA及蛋白表達影響不明顯。Cornpactin可以抑制HMCs與HepG2細胞HMGCoA還原酶的酶活性、上調(diào)mRNA 表達，然而當有IL-1β存在時，Compactin抑制酶活性、上調(diào)mRNA表達

9、的作用均被明顯減弱。 4．進一步，我們探討了IL-1β對LDLr/HMGCoA還原酶的上游調(diào)控蛋白——核轉(zhuǎn)錄因子SREBP-2和膽固醇敏感器SCAP的影響。LDL能降低SREBP-2和SCAP的mRNA水平，并抑制SCAP-SREBP復(fù)合物從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)移，這種抑制作用在HMCs更明顯，而當同時有IL-1β存在時，兩種細胞SREBP-2 mRNA表達均明顯增加，并且SCAP-SREBP復(fù)合物從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)移明顯增多，

10、從而可以進一步促進靶基因LDLr/HMGCoA還原酶的轉(zhuǎn)錄。 結(jié)論:生理 (非炎癥)情況下，胞內(nèi)膽固醇水平可以對兩種細胞SCAP-SREBP-LDLr/HMGCoA 還原酶產(chǎn)生負反饋調(diào)節(jié)，HMCs 較HepG2 細胞更敏感，使得外周細胞相對于肝細胞能在胞內(nèi)膽固醇水平升高時更迅速地減少外源膽固醇攝取和內(nèi)源膽固醇合成，防止了膽固醇在外周細胞的聚集。但在炎癥狀態(tài)下，由膽固醇介導(dǎo)的SCAP-SREBP-LDLr/HMGCoA 還原酶的嚴