炎癥引起膽固醇敏感器SCAP功能失調(diào)致泡沫細(xì)胞形成的分子機(jī)制.pdf

1、目的:細(xì)胞內(nèi)膽固醇主要來(lái)源于兩個(gè)方面，即外源性膽固醇攝入和內(nèi)源性膽固醇合成，它們均通過(guò)一個(gè)依賴(lài)于細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)的嚴(yán)密控制來(lái)保證膽固醇的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡，即主要通過(guò)SCAP-SREBP2-LDLr/HMGCoA reductase通路實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)。過(guò)去的研究中，我們已經(jīng)證實(shí)炎癥可以通過(guò)干擾膽固醇介導(dǎo)的LDLr負(fù)反饋調(diào)節(jié)來(lái)促進(jìn)外周細(xì)胞，如血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）及腎小球系膜細(xì)胞（HMCs）的膽固醇攝入，同時(shí)下

2、調(diào)ABCA1基因表達(dá)來(lái)減少膽固醇外流，從而導(dǎo)致膽固醇在外周細(xì)胞異常堆積形成泡沫細(xì)胞。本研究在過(guò)去研究的基礎(chǔ)上，選用人THP-1巨噬細(xì)胞和VSMCs細(xì)胞，①探討炎癥是否干擾巨噬細(xì)胞內(nèi)LDLr負(fù)反饋調(diào)控，從而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞大量攝入天然LDL形成泡沫細(xì)胞；②探討炎癥導(dǎo)致VSMCs細(xì)胞內(nèi)膽固醇敏感器SCAP從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常逃逸到高爾基體的分子機(jī)制；⑧比較生理?xiàng)l件及炎癥狀態(tài)下，巨噬細(xì)胞和VSMCs細(xì)胞LDLr負(fù)反饋調(diào)控的差異。 材料和方法:用酶

3、學(xué)法分別檢測(cè)THP-1巨噬細(xì)胞和VSMCs細(xì)胞內(nèi)總膽固醇（TC）、游離膽固醇（FC）和膽固醇酯（CE）的水平；油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚情況；提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（real-time quantitative PCR）檢測(cè) LDLr、SREBP2、SCAP、α-mannosidaseⅡ、SR-A和CD36 mRNA水平；用Western blotting法檢測(cè)LDLr、SREBP2和SCAP蛋白表達(dá)水平；用免疫

4、細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)α-mannosidaseⅡ蛋白表達(dá)水平；用抗人SCAP抗體和抗高爾基體抗體雙重染色后，激光共聚焦顯微鏡下觀察兩種細(xì)胞SCAP-SREBP2復(fù)合物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的定位；用免疫熒光法檢測(cè)巨噬細(xì)胞SR-A的蛋白表達(dá)；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)兩種細(xì)胞培養(yǎng)基中腫瘤壞死因子alpha（TNF-α）水平；應(yīng)用MTT法檢測(cè)兩種細(xì)胞在不同時(shí)間、不同濃度LPS刺激下的存活率。 結(jié)果:1.我們證實(shí)LPS通過(guò)LDLr增加

5、天然LDL在巨噬細(xì)胞內(nèi)積聚。進(jìn)一步，我們研究了炎癥狀態(tài)下，調(diào)控LDLr表達(dá)的兩個(gè)重要分子SCAP和SREBP2的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位。實(shí)驗(yàn)證實(shí)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)增加SCAP和SREBP2 mRNA和蛋白表達(dá)，進(jìn)而增大SCAP/Insig1比率，導(dǎo)致Insig1數(shù)量不足，不足以鎖定SCAP-SREBP2復(fù)合物，造成SCAP-SREBP2復(fù)合物即使在胞內(nèi)高濃度膽固醇水平下，仍從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逃逸到高爾基體。這種異常逃逸打破了LDLr的生理性負(fù)反饋調(diào)節(jié)

6、，進(jìn)而將THP-1巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞。 2.我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)高爾基體α甘露糖苷酶Ⅱ（α-mannosidaseⅡ）特異性抑制劑苦馬豆堿（swainsonine）能顯著抑制VSMCs細(xì)胞SCAP的異常逃逸，減少SCAP-SREBP2復(fù)合物從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)位至高爾基體，同時(shí)抑制SCAP和SREBP2 mRNA和蛋白表達(dá)，最終減少LDLr表達(dá)和外源性膽固醇的攝入，逆轉(zhuǎn)炎癥誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞形成，提示SCAP異常糖基化修飾可能是炎癥導(dǎo)致其在內(nèi)質(zhì)

7、網(wǎng)與高爾基體間異常循環(huán)的機(jī)制之一。同時(shí)，我們也觀察到苦馬豆堿的抑制效應(yīng)只在濃度為2.5和5μg/ml時(shí)出現(xiàn)，7.5μg/ml的苦馬豆堿反而上調(diào)LDLr表達(dá)。苦馬豆堿對(duì)α-mannosidaseⅡ特異性抑制，反饋性增加α-mannosidaseⅡ mRNA和蛋白表達(dá)。 3.生理情況下，巨噬細(xì)胞和VSMCs細(xì)胞負(fù)荷不同濃度LDL，兩種細(xì)胞LDLr表達(dá)都顯著減少，但VSMCs細(xì)胞LDLr的下調(diào)比巨噬細(xì)胞快，而且下調(diào)幅度更大，提示其“下

8、調(diào)敏感”，可以迅速關(guān)閉LDLr，減少脂質(zhì)攝??；當(dāng)有LPS存在時(shí)，兩種細(xì)胞LDLr表達(dá)均上調(diào)，但巨噬細(xì)胞LDLr被LPS上調(diào)的更快，幅度更大，提示其“上調(diào)易感”。同時(shí)，我們證實(shí)巨噬細(xì)胞SR-A水平表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單核細(xì)胞和VSMCs細(xì)胞。 結(jié)論:我們證實(shí)：炎癥可以導(dǎo)致巨噬細(xì)胞通過(guò)LDLr途徑大量攝入天然LDL，從而導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成，氧化LDL不是巨噬細(xì)胞泡沫化的唯一膽固醇來(lái)源，天然LDL同樣可以致動(dòng)脈粥樣硬化，這可能是巨噬細(xì)胞泡沫樣變

9、的另一條通路；炎癥可以增加高爾基體α-mannosidaseⅡ的活性，加強(qiáng)對(duì)SCAP的糖基化修飾，同時(shí)增加SCAP和SREBP2 mRNA和蛋白表達(dá)，促進(jìn)SCAP從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常逃逸到高爾基體，從而增加核轉(zhuǎn)錄因子SREBP2-N進(jìn)入胞核，啟動(dòng)LDLr表達(dá)，增加膽固醇攝入，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成；在生理情況下，加載LDL時(shí)，VSMCs細(xì)胞LDLr下調(diào)比巨噬細(xì)胞明顯、下調(diào)幅度更大，在炎癥刺激物L(fēng)PS作用下，巨噬細(xì)胞LDLr上調(diào)迅速，而且上調(diào)幅度更大，