高磷血癥致膽固醇敏感器SCAP功能失調(diào)促進動脈粥樣硬化的分子機制研究.pdf

1、第一部分高磷血癥通過誘導(dǎo)SCAP功能失調(diào)促進ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化
　　目的：
　　高磷血癥是慢性腎臟病患者動脈粥樣硬化性心血管疾病的重要危險因素，其促進動脈粥樣硬化的分子機制不清楚。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2（SREBP2）裂解激活蛋白（SCAP）是細(xì)胞內(nèi)的膽固醇敏感器，在反饋性調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)平衡中具關(guān)鍵作用。多項研究表明：病理狀態(tài)下SCAP功能失調(diào)可致多種外周細(xì)胞內(nèi)膽固醇異常聚集。本實驗擬通過建立ApoE-/-

2、小鼠高磷血癥模型，探討高磷狀態(tài)下膽固醇敏感器SCAP功能狀態(tài)對動脈粥樣硬化的影響及其分子機制。
　　方法：
　　8周齡雄性ApoE-/-小鼠隨機分為：正常飲食組（Chow組，含磷0.6%，n=8）、高磷飲食組（hP組，含磷1.6%，n=8）組、高磷飲食聯(lián)合司維拉姆組（hPS組，n=12）以及高磷血癥司維拉姆治療組（hPST組，n=8）。高磷飲食聯(lián)合司維拉姆組給予含有3%碳酸司維拉姆的高磷飲食，高磷血癥司維拉姆治療組則先給予高

3、磷飲食喂養(yǎng)8周成功建立高磷血癥，再繼續(xù)給予含有3%碳酸司維拉姆的高磷飲食。SPF級喂養(yǎng)共16周時處死小鼠，檢測血鈣、磷、尿素氮、血脂等生化指標(biāo)，制備主動脈連續(xù)冰凍切片并行油紅O染色評價粥樣硬化斑塊負(fù)荷，行免疫組化染色以及Western blot檢測SCAP、SREBP2、羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGCoAR）和低密度脂蛋白受體（LDLr）水平。
　　結(jié)果：
　　高磷飲食喂養(yǎng)8周時，ApoE-/-小鼠血磷水平顯著高于普

4、通飲食組，表明小鼠已出現(xiàn)高磷血癥。喂養(yǎng)16周時，高磷飲食組小鼠血磷仍顯著高于普通飲食組（P＜0.05），高磷飲食聯(lián)合司維拉姆組小鼠血磷較高磷飲食組明顯降低（P＜0.05），但高磷血癥司維拉姆治療組血磷仍顯著高于普通飲食組，且與高磷飲食組比較無差別。血尿素氮、血脂等指標(biāo)在四組小鼠間無顯著差異。主動脈根部連續(xù)冰凍切片油紅O染色及斑塊定量分析顯示：高磷飲食組小鼠粥樣斑塊負(fù)荷（以斑塊面積/血管截面積表示）顯著大于正常飲食組和高磷飲食聯(lián)合司維拉姆

5、組（P＜0.05），但與高磷血癥司維拉姆治療組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。免疫組織化學(xué)染色與Western blot檢測結(jié)果表明：高磷飲食組與高磷血癥司維拉姆治療組小鼠N-SREBP2、HMGCoAR、LDLr及SCAP蛋白水平明顯高于普通飲食組及高磷飲食聯(lián)合司維拉姆組。
　　結(jié)論：
　　高磷血癥通過上調(diào)血管組織細(xì)胞內(nèi)SCAP蛋白水平，使其異常運載SREBP2從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至高爾基體并經(jīng)酶解釋放其氨基端片段N-SREBP2，后者轉(zhuǎn)位入核并與

6、其靶基因啟動子上游的SRE結(jié)合，上調(diào)LDLr與HMGCoAR等靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進血漿中LDL經(jīng)LDLr攝入細(xì)胞內(nèi)，同時增加細(xì)胞內(nèi)源性膽固醇合成，最終促進Apo E-/-小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展?？诜捉Y(jié)合劑碳酸司維拉姆可有效預(yù)防高磷飲食引起的高磷血癥并減輕動脈粥樣硬化病變，但在已形成持續(xù)高磷血癥的小鼠，碳酸司維拉姆干預(yù)效果不理想，這可能與持續(xù)高磷血癥激活PTH、FGF-23等代償機制有關(guān)。
　　第二部分高磷環(huán)境下膽固醇敏感器S

7、CAP功能失調(diào)促進巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積
　　目的：
　　觀察高磷環(huán)境對巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇積聚的影響與分子機制。
　　方法：
　　將PMA誘導(dǎo)的THP-1源性巨噬細(xì)胞分為對照組（磷1.0 mmol/L）、高磷處理組（磷3.0 mmol/L）、磷甲酸鈉（PFA）處理組（PFA1.0 mmol/L）以及高磷聯(lián)合PFA處理組，無血清培養(yǎng)基中處理24小時后，油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)中性脂質(zhì)分布，酶法定量測定細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，Re

8、al time-PCR法測細(xì)胞內(nèi)羥甲基戊二酸單酰輔酶 A還原酶（HMGCoAR）、低密度脂蛋白受體（LDLr）、固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白（SCAP）mRNA表達，Western blot法測定細(xì)胞內(nèi)SCAP、LDLr、HMGCoAR及核內(nèi)固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白2（N-SREBP2）蛋白水平。
　　結(jié)果：
　　與對照組相比，高磷處理組巨噬細(xì)胞內(nèi)中性脂質(zhì)明顯聚集，高磷處理可顯著增加細(xì)胞內(nèi)總膽固醇與膽固醇酯的含量（P＜0.0

9、5），這種作用可被細(xì)胞表面鈉磷轉(zhuǎn)運體pit-1的特異性阻斷劑PFA所阻斷（高磷聯(lián)合PFA處理組）（P＜0.05）。高磷處理組巨噬細(xì)胞LDLr、HMGCoAR mRNA與蛋白表達水平均明顯高于對照組（P＜0.01），同時細(xì)胞核內(nèi)N-SREBP2水平也明顯增高，加入PFA（高磷聯(lián)合PFA處理組）可抑制上述效應(yīng)。進一步研究發(fā)現(xiàn)：高磷處理組巨噬細(xì)胞內(nèi)控制SREBP2轉(zhuǎn)位激活的關(guān)鍵伴侶分子 SCAP蛋白水平明顯增高（P＜0.05），但其mRNA表