馬兜鈴酸-Ⅰ致比格犬肝急性炎癥伴腫瘤祖細(xì)胞形成的分子機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:馬兜鈴酸-Ⅰ致比格犬肝急性炎癥伴腫瘤祖細(xì)胞形成
　　目的:明確馬兜鈴酸Ⅰ（Aristolochic acidⅠ，AAⅠ）致比格犬肝急性炎癥中，炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6（Interleukin6，IL-6）及炎癥信號(hào)通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子-3（Signaling transducer and activator of transcription-3，STAT3），轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB(Transcription fac

2、tors nuclear factor-κB，NF-κB)，探索急性炎癥環(huán)境下是否存在腫瘤祖細(xì)胞發(fā)生。
　　方法:健康成年比格犬8只，每組4只。實(shí)驗(yàn)組口服3 mg/kg/day AAⅠ膠囊，對(duì)照組口服輔料膠囊;連續(xù)給藥至第10天，并于第12天處死。蘇木素-伊紅(Hematoxylin&eosin，H&E)染色評(píng)價(jià)肝臟損傷狀況并采用TUNEL染色檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡情況。通過(guò)ELISA及RT-PCR分別檢測(cè)肝組織中IL-6釋放水平及基因表

3、達(dá)水平;采用免疫熒光，蛋白免疫印跡及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)IL-6下游炎癥信號(hào)通路白細(xì)胞介素-6受體β（Interleukin6 receptorα，IL-6Rα）/Janus酪氨酸激酶2（Janus tyrosine kinases2，JAK2）/STAT3，激活蛋白1(Activator protein1，AP-1)/NF-κB炎癥通路及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（Transforming growth factorβ，TGF-β）通路激活情況;

4、通過(guò)免疫組化表型鑒定，蛋白檢測(cè)及蛋白免疫共沉淀法檢測(cè)肝前體細(xì)胞發(fā)生情況;采用激光共聚焦結(jié)合免疫熒光法鑒定腫瘤祖細(xì)胞標(biāo)志。
　　結(jié)果:AAⅠ連續(xù)給藥10天，H&E染色組織切片顯示比格犬肝小葉紊亂，TUNEL免疫熒光染色呈現(xiàn)大量陽(yáng)染細(xì)胞，提示肝細(xì)胞發(fā)生凋亡。肝組織中IL-6表達(dá)水平上調(diào)，其下游通路IL-6Rα/JAK2/STAT3處于激活狀態(tài);同時(shí)炎癥相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB也處于激活狀態(tài)，說(shuō)明AAⅠ致比格犬肝損傷伴急性炎癥發(fā)生，其炎

5、癥主要由炎癥細(xì)胞因子IL-6及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB介導(dǎo)。免疫組化，免疫印跡及蛋白質(zhì)免疫共沉淀法系統(tǒng)地評(píng)價(jià)了在炎癥環(huán)境下，肝組織出現(xiàn)八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子-4（Octamer-binding transcription factor-4，Oct4），STAT3陽(yáng)染肝前體細(xì)胞，并伴有TGF-β1信號(hào)通路激活，推測(cè)急性炎癥期TGF-β1通路激活有利于肝前體細(xì)胞增殖分化。通過(guò)組織免疫熒光染色法確定了表型為Oct4陽(yáng)性，STAT3陽(yáng)性，TGF-β1Ⅱ

6、型受體(TGF-β1 receptorⅡ，TBRⅡ)陰性，胚胎肝胞襯蛋白(Embryonic liver fodrin，ELF)陰性的腫瘤祖細(xì)胞，證實(shí)腫瘤祖細(xì)胞出現(xiàn)在AAⅠ引發(fā)的肝急性炎癥環(huán)境中。
　　結(jié)論:AAⅠ致比格犬肝急性損傷，可見(jiàn)肝細(xì)胞凋亡伴T(mén)GF-β1信號(hào)通路與IL-6/STAT3/NF-κB同時(shí)激活，出現(xiàn)“Oct4+，STAT3+伴T(mén)BRⅡ-，ELF-”特征的腫瘤祖細(xì)胞。
　　第二部分:馬兜鈴酸-Ⅰ致比格犬肝臟m

7、iRNome改變與腫瘤祖細(xì)胞形成的相關(guān)性
　　目的:探索AAⅠ致比格犬急性炎癥伴腫瘤祖細(xì)胞發(fā)生過(guò)程miRNAs表達(dá)譜，明確miRNAs靶向轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的分子事件。
　　方法:采用Exiqon miRCURY LNATM芯片平臺(tái)檢測(cè)犬類miRNAs表達(dá)譜，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，并通過(guò)qRT-PCR法驗(yàn)證差異表達(dá)miRNAs(變化＞1.5倍，P＜0.05)。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)（www.targetscan.org），（www.mirbase.o

8、rg），(www.pubmed.com)推測(cè)miRNAs可能調(diào)控的靶基因，并通過(guò)蛋白免疫印跡法對(duì)其進(jìn)行確認(rèn)，采用激光共聚焦結(jié)合免疫熒光，檢測(cè)惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白促癌蛋白Myc(Oncogenic transcriptionfactor Myc，c-Myc)及癌胚RNA結(jié)合蛋白Lin28同源物B(Oncofetal RNA-bindingprotein Lin28 homolog B，Lin28B)表達(dá)情況。
　　結(jié)果: AAⅠ致肝組織

9、中73個(gè)miRNAs變化大于1.5倍，其中cfa-miR-200c，cfa-miR-34a,cfa-miR-378,cfa-miR-223,cfa-miR-24,cfa-let-7b變化＞1.5倍，P＜0.05。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，qRT-PCR驗(yàn)證以上6個(gè)miRNAs及l(fā)et-7a-1～let-7b簇，miR-27a～miR-24簇成員let-7a-1及miR-27a表達(dá)水平均呈現(xiàn)出不同程度差異表達(dá)（變化＞1.5倍，P＜0.05）。通

10、過(guò)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析與預(yù)測(cè)，及蛋白免疫印跡驗(yàn)證，證明了以上miRNAs調(diào)控的10個(gè)靶蛋白表達(dá)均發(fā)生了不同程度改變，其中7個(gè)蛋白變化＞1.5倍，P＜0.05。值得引起關(guān)注的是，磷酸化叉頭框O1（Phospho-forkhead box O1，p-FOXO1）表達(dá)增加22倍，同時(shí)伴有c-Myc和Lin28B，高表達(dá)，提示惡性轉(zhuǎn)化事件的發(fā)生可能與腫瘤祖細(xì)胞發(fā)生相關(guān)聯(lián)。
　　結(jié)論:AAⅠ致比格犬肝臟炎性惡變過(guò)程中，miRNAs呈現(xiàn)差異表

11、達(dá)譜，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果揭示miRNAs let-7a-1，let-7b，miR-27a，miR-223，miR-200c，miR-24，miR-34a，miR-378差異顯著，明顯受調(diào)控的靶蛋白是IL-6,NF-κB,Lin28B,c-Myc和p-FOXO1。
　　第三部分:Let-7b及miR-27a參與調(diào)控IL-6引發(fā)的HepG2細(xì)胞炎性惡變體外分子機(jī)制研究
　　目的:探索miRNAs let-

12、7b，miR-27a是否與炎癥細(xì)胞因子IL-6，核轉(zhuǎn)錄NF-κB及抗凋亡蛋白p-FOXO1存在相互聯(lián)系進(jìn)而促進(jìn)炎性惡變，明確上述分子所存在的饋路關(guān)系。
　　方法:將let-7b擬似物及抑制劑轉(zhuǎn)入人肝癌HepG2細(xì)胞，并外源性加入IL-6，觀察細(xì)胞增殖克隆情況;采用蛋白免疫印跡檢測(cè)Lin28B表達(dá)水平;采用免疫熒光法檢測(cè)STAT3及p-FOXO1在胞漿中共定位情況。在外源性加入IL-6條件下，分別檢測(cè)HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)入let-7b及

13、miR-27a擬似物或抑制劑后，分子通路p-STAT3，F(xiàn)OXO1，p-FOXO1，NF-κB(P50，P65)表達(dá)情況。
　　結(jié)果:軟瓊脂糖增殖克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示let-7b擬似物可抑制克隆形成，相反，let-7b抑制劑則促進(jìn)克隆形成，IL-6具有促進(jìn)克隆形成作用。蛋白免疫印跡系統(tǒng)闡明了IL-6可激活p-STAT3，并促使NF-κB上調(diào)。一方面，在IL-6/NF-κB聯(lián)合作用下Lin28B上調(diào)，抑制let-7b，let-7b下調(diào)進(jìn)

14、一步促進(jìn)IL-6/NF-κB表達(dá);另一方面，F(xiàn)OXO1受miR-27a調(diào)控。以上結(jié)果提示存在信號(hào)饋路IL-6/STAT3/NF-κB/Lin28B/let-7及IL-6/NF-κB/miR-27a/FOXO1與肝腫瘤祖細(xì)胞生成事件相關(guān)。
　　結(jié)論:AAⅠ致比格犬肝臟急性炎性惡變過(guò)程中，IL-6/STAT3/NF-κB/Lin28B/let-7b饋路耦聯(lián)IL-6/NF-κB/miR-27a/FOXO1與肝腫瘤祖細(xì)胞生成事件相關(guān)。Le