限進(jìn)色譜及質(zhì)譜技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用研究.pdf

1、本研究合成并評(píng)價(jià)了4種色譜限進(jìn)填料(restrictedaccessmaterial,RAM)。通過自制RAMC18預(yù)柱，建立了在線樣品預(yù)處理HPLC柱切換系統(tǒng)測定人血清卡馬西平和多奈哌齊的方法。利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了體內(nèi)福多司坦血藥濃度測定方法，并成功地應(yīng)用于藥物動(dòng)力學(xué)研究。全文分五章。
　　第一章，介紹了體內(nèi)藥物分析研究進(jìn)展，生物樣品在線前處理技術(shù)，蛋白相容限進(jìn)色譜填料的研究情況，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLCtan

2、demmassspectrometry,HPLC/MS/MS)技術(shù)。
　　第二章，介紹了4種RAM色譜填料的合成情況，對(duì)其反相性能、陰離子保留性能、蛋白洗脫性能、耐用性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。元素分析結(jié)果RAMC185μm填料C含量為12.58％，H含量為2.30％，RAMC1810μm填料C含量為15.89％，H含量為2.82％，提示鍵合反應(yīng)順利。陰離子交換RAM-1填料C、H、N含量分別為7.46％，1.51％，0.75％，陰離子交換RA

3、M-2填料C、H、N含量分別為8.39％，1.73％，1.61％，提示鍵合反應(yīng)順利。以卡馬西平、戊巴比妥鈉、巴比妥、苯巴比妥對(duì)照品溶液作為反相評(píng)價(jià)藥物，對(duì)RAMC18柱的反相特性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，流動(dòng)相為水-甲醇(60:40,v/v)，流速為1.0mL/min。在該條件下洗脫順序依次為：戊巴比妥鈉(0.65min)、巴比妥(0.73min)、苯巴比妥(1.82min)、卡馬西平(4.28min)，證實(shí)填料具有較好的反相特性。以戊巴比妥鈉、氨基

4、苯甲酸、對(duì)氨基水楊酸鈉對(duì)照品溶液作為離子交換評(píng)價(jià)藥物，對(duì)陰離子交換RAM-1預(yù)柱的陰離子保留特性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，流動(dòng)相為水-甲醇(60:40,v/v)，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為20μL。結(jié)果表明，在所選洗脫條件下戊巴比妥鈉、氨基苯甲酸、對(duì)氨基水楊酸鈉對(duì)照品溶液的保留時(shí)間均大于15min，證實(shí)合成的兩種陰離子交換RAM色譜填料對(duì)陰離子化合物具有較好的保留特性。以德國MERCK公司同類型產(chǎn)品LiChrospherADSC18為參照，比

5、較了實(shí)驗(yàn)合成4種規(guī)格RAM色譜填料同MERCK公司同類產(chǎn)品蛋白洗脫性能(限進(jìn)性能)。評(píng)價(jià)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)合成的RAMC18反相色譜硅膠填料同MERCK公司同類型產(chǎn)品LiChrospherADSC18色譜硅膠填料蛋白洗脫性能相類似。實(shí)驗(yàn)合成的陰離子交換RAM-1、陰離子交換RAM-2色譜硅膠填料亦有著較好的蛋白洗脫性能。說明所得填料的色譜行為完全符合RAM色譜柱填料的特征。RAM柱耐用性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示經(jīng)過多次血清進(jìn)樣后，4種RAM柱柱壓基本保持

6、穩(wěn)定，表明所合成的RAM填料具有較好的耐用性。
　　第三章，通過自制RAMC18色譜填料預(yù)柱，建立了在線樣品預(yù)處理HPLC柱切換系統(tǒng)測定人血清卡馬西平和多奈哌齊的方法。含卡馬西平血清樣品預(yù)處理采用自制RAMC18(4.6mm×10mm，10μm)預(yù)柱，分析柱為：
　　Microsorb-MVC18column(4.6mm×150mm，4μm)，以水-甲醇(95:5,v/v)為血清蛋白沖洗流動(dòng)相，流速2mL/min，水-甲醇(

7、40:60,v/v)為分析流動(dòng)相，流速0.8mL/min，柱溫：室溫，檢測波長285nm。切換閥切換時(shí)間為3.0min，卡馬西平的保留時(shí)間為9.2min，分析周期為12.0min。結(jié)果顯示本方法線性范圍為2.0～40.0μg/mL，r=0.9997，LOQ為2μg/mL，日內(nèi)、日間精密度RSD小于5％，方法回收率均大于95％。
　　含多奈哌齊血清樣品預(yù)處理采用自制RAMC18(4.6mm×10mm，10μm)預(yù)柱，分析柱為Micr

8、osorb-MVC18column(4.6mm×150mm，4μm)，以水-乙腈(99:1,v/v)為血清蛋白沖洗流動(dòng)相，流速2mL/min，分析流動(dòng)相由20mM磷酸鹽緩沖液（pH4.6）-乙腈-三乙胺(65:35:0.1,v/v)組成，流速1mL/min，柱溫為室溫，檢測波長315nm。切換閥切換時(shí)間為5.5min，多奈哌齊的保留時(shí)間為11.5min，分析周期為16.0min。結(jié)果顯示本方法線性范圍為0.02～1μg/mL，r=0.9

9、995，LOQ為0.02μg/mL，日內(nèi)、日間精密度RSD小于7％，回收率為87.9％～89.2％。
　　在線樣品預(yù)處理HPLC柱切換系統(tǒng)串聯(lián)了RAM反相預(yù)柱和C18分析柱，分析時(shí)間短，顯著降低了萃取及分離的時(shí)間，且回收率較高。同離線血液中藥物測定方法相比，本方法顯著降低了樣品前處理的時(shí)間，分析條件易于實(shí)現(xiàn)，成本亦較低。
　　第四章，建立了HPLC/MS/MS技術(shù)定量測定血清中福多司坦血藥濃度方法，并對(duì)福多司坦藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

10、進(jìn)行了研究。質(zhì)譜檢測采用多反應(yīng)監(jiān)測模式(Multireactionmoniter,MRM)，使用ESI離子源，正離子模式，主要質(zhì)譜參數(shù)為源溫度500?C，掃描間隔200ms，離子源氣流60～70psi，氣簾氣流20psi，碰撞氣流5psi，噴霧電壓5500V，去簇電壓16V，入口電壓10V，碰撞電壓22V，碰撞池出口電壓14.7V，福多司坦離子對(duì)選擇質(zhì)荷比為180.2/91.0。含福多司坦血清樣品預(yù)處理采用蛋白沉淀法。色譜分離采用Mic

11、rosorb-MVC18柱(4.6mm×150mm,5μm，Varian，美國)，分離溫度為30℃，流動(dòng)相為20mM甲酸-乙腈(75:25,v/v)，流速為0.40mL/min。結(jié)果顯示，血清內(nèi)源性物質(zhì)及其他雜質(zhì)不會(huì)干擾福多司坦樣品的分離測定，福多司坦的保留時(shí)間為3.60min，分析周期為4.0min。本方法線性范圍為100～20000ng/mL，r=0.9998，日內(nèi)、日間精密度RSD小于5％，萃取回收率方法回收率均大于80％。該方法

12、不需進(jìn)行柱前或柱后衍生化即可對(duì)血清中的福多司坦進(jìn)行定量測定，簡化了福多司坦的測定方法，縮短了樣品處理時(shí)間且減少了變異因素的引入，為直接快速定量測定生物樣本中氨基酸提供了新的方法和解決途徑。
　　第五章，建立了RP-HPLC同時(shí)測定含丹參的中藥制劑中隱丹參酮、丹參酮Ι、丹參酮ⅡA含量的方法。采用Microsorb-MVC18色譜柱（4.6mm×150mm,5μm），甲醇-四氫呋喃-水(25:30:45,v/v)為流動(dòng)相，流速：1.0