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文檔簡介
1、目的:糖尿病周圍神經(jīng)病變是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量,臨床缺乏有效的治療方法。因此,研究療效可靠的中藥或有效成分具有重要的臨床應(yīng)用意義?,F(xiàn)代藥理研究表明:黃連及其生物堿成分(小檗堿)對于改善糖尿病及其并發(fā)癥具有明顯效果。因此,本實(shí)驗(yàn)建立2型糖尿病大鼠模型,探討黃連生物堿預(yù)防給藥對糖尿病周圍神經(jīng)病變和糖尿病肌病的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。 方法: 1.建立高效液相色譜法測定黃連中生物堿含量的方法;
2、2.以小檗堿、巴馬汀、黃連堿、表小檗堿和藥根堿的總提取率作為篩選指標(biāo),通過正交實(shí)驗(yàn)篩選黃連主要活性成分的最佳提取工藝; 3.采用腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素和高熱量飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型,設(shè)立黃連生物堿低、中、高劑量組,以等劑量小檗堿原料藥為對照;觀察黃連生物堿對其體重、糖代謝、脂代謝,坐骨神經(jīng)感覺和運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)功能,血液流變學(xué)改變,光鏡及電鏡下超微結(jié)構(gòu)的影響;并主要從糖尿病引起的代謝障礙角度,探討了黃連生物堿對糖尿病大鼠多元醇
3、代謝通路,氧自由基損傷以及神經(jīng)營養(yǎng)因子變化的影響; 4.觀察黃連生物堿對糖尿病大鼠骨骼肌糖原儲(chǔ)備,抗氧自由基損傷能力,復(fù)合肌肉動(dòng)作電位,骨骼肌病理形態(tài)改變,運(yùn)動(dòng)終板形態(tài)和數(shù)量的影響。應(yīng)用PCR和免疫印跡技術(shù)觀察黃連生物堿對骨骼肌胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受體后水平的影響。 結(jié)果: 1.采用離子對高效液相色譜法,在流動(dòng)相為乙腈:0.05mol·L<'-1>磷酸二氫鉀(40:60,內(nèi)含0.015mol·L<'-1>十二烷基磺
4、酸鈉),檢測波長345nm,柱溫37℃,流速1.2ml/min的色譜條件下,可同時(shí)分離和測定黃連中5種生物堿的含量,其含量由高到低的順序?yàn)樾¢迚A>黃連堿>巴馬汀≥表小檗堿>藥根堿,它們之間的含量比例約為7.7:2.5:2.2:2.1:1。 2.采用8ml/g的液料比,50%乙醇回流提取4次,每次提取120min的條件提取并減壓濃縮得到黃連生物堿浸膏。浸膏中生物堿的含量分別為16.04+0.12%(15g生藥)和15.97±0.2
5、0%(150g生藥)。經(jīng)高效液相色譜法定量,黃連浸膏和黃連生物堿制品的純度分別為63.49±1.37%和95.64±2.20%。經(jīng)薄層色譜定性,黃連浸膏及黃連生物堿制品各成分的斑點(diǎn)位置與對照品色譜相對應(yīng)。 3.黃連生物堿對糖尿病周圍神經(jīng)的保護(hù)作用 ①黃連生物堿對STZ糖尿病大鼠的體重?zé)o明顯性影響,但可降低糖尿病大鼠空腹血糖和糖化血紅蛋白比值、降低血清總膽固醇和甘油三酯水平,提高糖尿病大鼠血清胰島素水平。 ②神
6、經(jīng)傳導(dǎo):模型組的MNCV和SNCV均較空白組減慢(P<0.05)。黃連生物堿可抑制坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度的減慢,AM組SNCV較模型組明顯提高(P<0.05),AH組MNCV和SNCV較模型組明顯提高(P<0.05)。 ③血液流變學(xué):黃連生物堿可降低大鼠全血粘度、血漿粘度和紅細(xì)胞聚集指數(shù),縮短紅細(xì)胞電泳時(shí)間。AM組和AH組大鼠的全血粘度(高切200/S、中切30/S、低切3/S)、血漿粘度和紅細(xì)胞電泳時(shí)間較BM組和BH組有顯著性差異(
7、P<0.05)。AH組的紅細(xì)胞聚集指數(shù)較BH組有顯著性差異(P<0.05)。 ④黃連生物堿可不同程度地減輕坐骨神經(jīng)的病理改變:降低糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)發(fā)生潰變的比例,增加有髓鞘神經(jīng)纖維密度,減少有髓神經(jīng)纖維平均截面積。AH組未見明顯的髓鞘分離,療效優(yōu)于AM組和AL組。AH組大鼠坐骨神經(jīng)發(fā)生潰變的比例明顯低于模型組(P<0.05),AH組有髓神經(jīng)纖維截面積明顯少于模型組(P<0.05)。 ⑤氧自由基代謝: AM組、AH組血
8、漿CArr活性較模型組明顯升高(P<0.05);AH組坐骨神經(jīng)中CAT活性較模型組升高(P<0.05)。AH組的血漿和坐骨神經(jīng)中SOD活性較模型組明顯升高(P<0.05)。AH組血漿GSH-PX活性較模型組升高(P<0.05)。AM組、AH組血漿和坐骨神經(jīng)。MDA含量較模型組降低(P<0.05)。 ⑥多元醇代謝通路:黃連生物堿預(yù)防給藥后,AM組、AH組大鼠的紅細(xì)胞醛糖還原酶活性和坐骨神經(jīng)ARmRNA的表達(dá)較模型組明顯降低(P<0
9、.05)。 ⑦坐骨神經(jīng)營養(yǎng)因子:黃連生物堿預(yù)防給藥后,AM組、AH組大鼠坐骨神經(jīng)IGF-1mRNA的表達(dá)較模型組明顯升高(P<0.05),AH組坐骨神經(jīng)IGF-1mRNA表達(dá)較BH組有顯著性差異(P<0.05)。 4.黃連生物堿對糖尿病肌病的保護(hù)作用 ①黃連生物堿中劑量和高劑量可明顯升高大鼠肌糖原水平,其中AH組大鼠肌糖原水平較模型組明顯升高(P<0.05)。 ②自由基:黃連生物堿可升高骨骼肌CAT、GS
10、H-PX活性,降低SOD活性和MDA含量,其中AM組、AH組骨骼肌CAT、GSH-PX活性升高,SOD活性和MDA含量明顯降低,較模型組有顯著性差異(P<0.05)。 ③復(fù)合肌肉動(dòng)作電位:黃連生物堿預(yù)防給藥組大鼠復(fù)合肌肉動(dòng)作電位的潛伏期縮短,動(dòng)作電位的傳導(dǎo)速度加快。AM組、AH組傳導(dǎo)速度明顯快于模型組(P<0.05)。 ④IRS-1:黃連生物堿對IRS-1mRNA和IRS-1蛋白表達(dá)有不同程度的上調(diào)作用。AM組和AH
11、組與模型組相比,有顯著性差異(P<0.05),高劑量的上調(diào)最強(qiáng)。其中AH組骨骼肌IRS-1蛋白表達(dá)較BH組有顯著性差異(P<0.05)。 ⑤Akt:黃連生物堿對AktlmRNA表達(dá)有輕微的上調(diào)作用,但與模型組比較無顯著差異(P>0.05)。AH組骨骼肌Akt2mRNA表達(dá)較模型組明顯升高(P<0.05)。骨骼肌中p-Akt蛋白表達(dá)增加,與模型組無顯著性差異(P>0.05)。 ⑥Glut4:黃連生物堿預(yù)防給藥組大鼠骨骼肌G
12、lut4mRNA和Glut4膜蛋白的表達(dá)增加。AM組和AH組骨骼肌Glut4mRNA和Glut4膜蛋白的表達(dá)較模型組明顯增加(P<0.05)。 ⑦p38MAPK:黃連生物堿明顯升高骨骼肌p38MAPK蛋白的表達(dá),較模型組有顯著性差異(P<0.05)。AM組和AH組大鼠骨骼肌p38MAPK蛋白表達(dá)高于BM組和BH組(P<0.05)。 結(jié)論: 1.該色譜條件可同時(shí)分離和測定黃連中5種生物堿的含量,方法靈敏、定量準(zhǔn)確。
13、 2.采用該工藝回流提取,黃連有效成分的提取率較高,提取工藝穩(wěn)定。 3.黃連生物堿通過降低糖尿病大鼠空腹血糖、糖化血紅蛋白比值和血清甘油三脂和膽固醇水平,提高糖尿病大鼠血漿胰島素水平。 4.提高坐骨神經(jīng)感覺和運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度,縮短動(dòng)作電位潛伏期;調(diào)節(jié)自由基代謝紊亂,減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng);抑制多元醇代謝通路中AR活性和改善血液高粘狀態(tài);增加坐骨神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)而改善糖尿病大鼠周圍神經(jīng)功能和結(jié)構(gòu),提示黃連生物堿對糖尿病周
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