漢族BPD SP-B遺傳缺陷基因分析及其導(dǎo)致BPD作用機(jī)制研究.pdf

1、支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是早產(chǎn)兒常見(jiàn)的慢性肺疾病,發(fā)病率在<1000g的早產(chǎn)兒中高達(dá)70％,病死率達(dá)50.7％,是早產(chǎn)兒的主要死因和兒童慢性肺疾患的主要病因。肺表面活性物質(zhì)蛋白B(pulmonarysurfactant protein B,SP-B)是髓磷脂合成和肺表面活性物質(zhì)形成所必需的物質(zhì),在正常肺以及表面活性物質(zhì)的功能中起著關(guān)鍵的作用。SP-B遺傳缺陷者可導(dǎo)致嚴(yán)重BPD,探討

2、SP-B遺傳缺陷在BPD發(fā)病中的遺傳作用機(jī)制是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本研究擬采用免疫組化、免疫熒光、DNA測(cè)序等技術(shù)對(duì)國(guó)內(nèi)漢族BPD患兒支氣管和肺部SP-B的含量、SP-B的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)分析,并對(duì)漢族BPD患兒氣道灌洗液中的細(xì)胞因子、肺組織中的SP-B、SP-C、TGF-β1及TTF-1蛋白進(jìn)行測(cè)定,同時(shí)采用電鏡觀測(cè)肺組織的超微結(jié)構(gòu),最終探明SP-B遺傳缺陷是否為漢族BPD發(fā)病的遺傳因素及其導(dǎo)致BPD的可能機(jī)制。
　　 目的

3、r>　　 探討漢族BPD的臨床資料以及對(duì)新生兒健康的影響。
　　 方法
　　 對(duì)2007年1月1日到2009年12月31日北京軍區(qū)總醫(yī)院附屬八一兒童醫(yī)院住院早產(chǎn)兒的民族、性別、胎齡、合并BPD的例數(shù)、合并癥等因素進(jìn)行了回顧性分析。數(shù)據(jù)結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果
　　 4531例新生兒中有4259例是漢族人,其中885例早產(chǎn)兒中有161例發(fā)生BPD,出生胎齡<30周的發(fā)生率為33

4、.3％；出生體重<1200g早產(chǎn)兒BPD的發(fā)生率為50.7％,出生體重<1400g早產(chǎn)兒的24.8％；男性發(fā)生率為22.8％(119/521):女性發(fā)生率為11.5％(42/364)。從年度發(fā)生率來(lái)看,BPD總發(fā)生率在逐年增加(約0.6％/年)。多胎兒(40.0％)發(fā)生BPD的可能性大于單胎(17.7％)及雙胎(17.2％),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.016)。BPD的發(fā)生與呼吸機(jī)持續(xù)的氣壓傷(天數(shù)及強(qiáng)度)有密切關(guān)系(P=0.000),使用

5、高氧(FiO2≥40％)在BPD組也明顯高于非BPD組,表明使用高濃度氧是BPD發(fā)生的因素之一。另外,NRDS、肺炎、心功能不全、窒息、HIE、肺出血、PPHN、PDA、氣胸、敗血癥、貧血的發(fā)生率BPD組與非BPD組相比差異有顯著性意義(P=0.000),表明以上因素為BPD發(fā)生的高危因素。
　　 結(jié)論
　　 胎齡和出生體重越小,BPD的發(fā)生率越高,因此加強(qiáng)孕期保健,避免早產(chǎn)(尤其胎齡<30周)是避免發(fā)生BPD的關(guān)鍵；早

6、產(chǎn)兒合并NRDS、肺炎、心功能不全、窒息、HIE、肺出血、PPHN、PDA、氣胸、敗血癥、貧血是BPD發(fā)生的高危因素,因此對(duì)于這部分患兒應(yīng)盡早采取綜合防治措施,降低BPD的發(fā)生,減少對(duì)新生兒健康的危害。
　　 目的
　　 了解漢族支氣管肺發(fā)育不良患兒的肺泡表面活性物質(zhì)蛋白B的基因缺陷是否為漢族BPD發(fā)病的遺傳因素。
　　 方法
　　 本組病人來(lái)源見(jiàn)第一部分,選取資料完整的30例作為病例組,選擇同期資料完整

7、的30例非BPD作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組患兒的性別、出生胎齡、出生體重等一般情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),在平均用氧和機(jī)械通氣時(shí)間上差異有極顯著意義(P<0.01)。每個(gè)病人采1ml靜脈或動(dòng)脈血,使用非離心柱法提取血液基因組DNA,PC
　　 結(jié)論
　　 漢族BPD患兒SP-B外顯子4的核苷酸131T/C核苷酸的變異,使氨基酸從蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼?改變了N-端糖基化的識(shí)別序列,這一變化可能潛在的影響到了SP-B

8、的加工過(guò)程和/或功能,降低了SP-B的功能,這可能是漢族BPD發(fā)病的遺傳因素。但是,外顯子3第68aaCTA-ATA Leu-Ile的突變是否會(huì)對(duì)早產(chǎn)兒避免BPD的發(fā)生起保護(hù)作用還有待有進(jìn)一步研究證實(shí)。
　　 第一章 支氣管肺發(fā)育不良組織形態(tài)學(xué)改變及肺組織SP-B和SP-C的表達(dá)
　　 目的
　　 研究BPD患兒肺組織組織形態(tài)學(xué)改變以及肺組織中表面活性相關(guān)蛋白B(SP-B)和表面活性相關(guān)蛋白C(SP-C)的表達(dá)變

9、化。
　　 方法
　　 病人的選取同前,死亡病人在取得醫(yī)院倫理委員會(huì)和患兒家長(zhǎng)同意后,進(jìn)行尸解,取肺組織制作石蠟切片,HE染色看肺組織形態(tài)學(xué)改變,采用戊二醛-鋨酸雙重固定法觀察肺組織超微結(jié)構(gòu)。用免疫組化方法檢測(cè)肺組織內(nèi)SP-B和SP-C的表達(dá)；用熒光定量PCR方法檢測(cè)肺組織SP-B mRNA和SP-C mRNA表達(dá)；Western Blot方法檢測(cè)肺組織SP-B和SP-C蛋白表達(dá)；數(shù)據(jù)用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

10、
　　 結(jié)果
　　 形態(tài)學(xué)改變?yōu)锽PD肺組織較對(duì)照組肺組織肺泡數(shù)量減少且肺泡大小不一致,部分肺泡管腔直徑明顯增大,并出現(xiàn)多個(gè)肺泡融合,形成肺大泡,融合肺泡間隔菲薄或消失。電鏡觀察到BPD組肺組織肺泡數(shù)目減少,板層小體和微絨毛明顯減少,胞核結(jié)構(gòu)松散、水腫,胞質(zhì)內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器較少,可見(jiàn)線粒體腫脹,線粒體嵴斷裂。免疫組化結(jié)果顯示兩組呼吸道無(wú)纖毛柱狀上皮細(xì)胞、終末細(xì)支氣管的立方狀上皮細(xì)胞胞漿、AECⅡ細(xì)胞胞漿

11、中SP-B和SP-C的陽(yáng)性表達(dá),對(duì)照組肺組織SP-B(++++)、SP-C(++++)著色面積大于75％,BPD組SP-B(+++)、SP-C(+++)著色面積在50％-75％。BPD組SP-B、SP-C表達(dá)較對(duì)照組減少。SP-B和SP-CmRNA、蛋白表達(dá)則在BPD組中明顯下降,差異具有顯著性(P=0.000)。
　　 結(jié)論
　　 支氣管肺發(fā)育不良患兒肺組織中SP-B和SP-C的表達(dá)明顯較正常對(duì)照組降低,說(shuō)明肺泡表面活

12、性物質(zhì)蛋白參與了BPD的發(fā)病過(guò)程,同時(shí)提示我們外源性表面活性物質(zhì)替代治療可能為BPD的治療方式之一。
　　 目的
　　 研究BPD患兒肺組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transformating GrowthFactot beta 1,TGF-β1)和甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1(Thyroid transcription factor1,TTF-1)的表達(dá)變化。
　　 方法
　　 病人的選取同前,死亡病人在取得醫(yī)院倫理

13、委員會(huì)和患兒家長(zhǎng)同意后,進(jìn)行尸解,取肺組織制作石蠟切片。用免疫組化方法檢測(cè)肺組織內(nèi)TGF-β1和TTF-1的表達(dá)；用熒光定量PCR方法檢測(cè)肺組織TGF-β1mRNA和TTF-1 mRNA表達(dá)；Western Blot方法檢測(cè)肺組織TGF-β1和TTF-1蛋白表達(dá)；數(shù)據(jù)用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果
　　 免疫組化結(jié)果顯示TTF-1表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞胞核呈棕黃色顆粒著色,在肺泡Ⅱ型細(xì)胞和呼吸性支氣管上皮胞核都有

14、表達(dá),肺組織TGF-β1表達(dá)在肺泡巨噬細(xì)胞和Ⅱ型上皮細(xì)胞。非BPD組TTF-1(+++)、TGF-β1(++),BPD組’FTF-1(++++)、TGF-β(+++)。肺組織TGF-β1和TTF-1 mRNA、蛋白表達(dá)則在BPD組較對(duì)照組升高,差異具有顯著性(P=0.000)。
　　 結(jié)論
　　 支氣管肺發(fā)育不良患兒肺組織中肺組織TGF-B1和TTF-1的表達(dá)較對(duì)照組升高,說(shuō)明BPD發(fā)病過(guò)程中肺纖維化與TGF-β1相關(guān),

15、適當(dāng)干預(yù)TGF-β1,可能會(huì)減輕BPD的發(fā)病進(jìn)程；TTF-1是調(diào)控SP-B和SP-C的關(guān)鍵因子,本研究顯示BPD組TTF-1的表達(dá)是升高的,可能與BPD時(shí)肺泡表面活性物質(zhì)蛋白降低,反饋性引起TTF-1的升高,但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。
　　 目的
　　 了解支氣管肺發(fā)育不良新生兒肺灌洗液IL-8、SP-A和TGF-β1的表達(dá)。
　　 方法
　　 共有60名患者入選本研究。將我院2007年1月至

16、2009年12月診斷為BPD的30名新生兒作為實(shí)驗(yàn)組。另外選同期30例非BPD患兒作為對(duì)照組,兩組在胎齡、性別、出生體重等無(wú)差異。采用非纖維支氣管鏡支氣管肺泡灌洗法進(jìn)行肺灌洗,用ELISA法測(cè)定IL-8、SP-A和TGF-β1的含量。
　　 結(jié)果
　　 BPD組肺泡灌洗液中TGF-β1、IL-8含量高于對(duì)照組,兩者相比差異有顯著性(p=0.001,p=0.000)。BPD組SP-A含量減低,較對(duì)照組相比差異有顯著性(P=

17、0.045)。
　　 結(jié)論
　　 TGF-β1在BPD患兒肺灌洗液中有過(guò)高表達(dá),可能與BPD患兒肺的異常發(fā)育與成熟有關(guān)。BPD患兒的支氣管灌洗液中均可檢測(cè)到高表達(dá)的IL-8,表明炎癥反應(yīng)與BPD的發(fā)生密切相關(guān)。BPD組SP-A含量較低,提示給予SP-A外源性治療有可能為BPD的治療手段之一。
　　 目的
　　 測(cè)定BPD患兒血漿白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和白介素8(IL-8)的表達(dá),了

18、解炎癥反應(yīng)在BPD發(fā)病機(jī)制中所起到的作用。
　　 方法
　　 將我院2007年1月至2009年12月診斷為BPD的30名新生兒作為實(shí)驗(yàn)組,另外選同期30例非BPD患兒作為對(duì)照組,兩組在胎齡、性別、出生體重等無(wú)差異。各組入選者均采靜脈血2ml,離心后取上清,用ELISA法測(cè)定血清中IL-1β、IL-6、IL-8的含量,并使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)論
　　 炎癥反應(yīng)在BPD的發(fā)病中