近親結(jié)婚導(dǎo)致的遺傳性凝血因子Ⅹ缺陷癥家系表型與基因分析.pdf

1、目的：凝血和抗凝，兩者之間的動(dòng)態(tài)平衡是維持機(jī)體內(nèi)血液流動(dòng)狀態(tài)和防止血液丟失的關(guān)鍵。一旦凝血因子或抗凝因子發(fā)生缺陷，很容易打亂這種平衡，從而誘發(fā)出血或血栓形成性疾病。凝血因子Ⅹ（congulation factorⅩ，F(xiàn)Ⅹ）是人體內(nèi)重要的促凝蛋白，參與內(nèi)源性和外源性凝血系統(tǒng)的共同通路，一旦缺乏，將可能引起機(jī)體嚴(yán)重出血。遺傳性凝血因子Ⅹ缺陷癥是單基因的常染色體隱性遺傳性疾病，由合成該蛋白的基因突變所致。因此，對(duì)該類疾病進(jìn)行表型診斷及基因分析

2、，闡明疾病的發(fā)生機(jī)制，能夠?yàn)榇祟惣膊〉念A(yù)防、治療、產(chǎn)前診斷提供可靠的理論依據(jù)。本研究通過對(duì)一例近親結(jié)婚導(dǎo)致的遺傳性FⅩ缺陷癥家系進(jìn)行表型檢測(cè)與基因分析，明確患者的基因突變類型，并采用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對(duì)其突變位點(diǎn)進(jìn)行分析，初步探討其分子致病機(jī)理。
　　方法：⑴收集該患者及其家系成員的枸櫞酸鹽抗凝靜脈血，在STA-R全自動(dòng)血凝分析儀上采用一期凝固法檢測(cè)血漿凝血酶原時(shí)間（prothrombin time， PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間

3、（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）含量、凝血因子Ⅱ活性（factorⅡactivity，F(xiàn)Ⅱ:C）、凝血因子Ⅴ活性（factorVactivity， FV:C）、凝血因子Ⅶ活性（factorⅦactivity，F(xiàn)Ⅶ:C）和凝血因子Ⅹ活性（factorX activity，F(xiàn)X:C），采用ELI

4、SA方法檢測(cè)FⅩ抗原（FX antigen，F(xiàn)S:Ag）含量。⑵提取該先證者及家系成員的外周血基因組DNA，設(shè)計(jì)引物并采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerse chain reaction，PCR）擴(kuò)增FⅩ基因的全部8個(gè)外顯子，5’、3’非編碼區(qū)及側(cè)翼序列；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與美國(guó)國(guó)立生物信息中心（Nationl Center for Biotechnology Information，NCBI）提供的FⅩ基因序列進(jìn)行比對(duì)，找出

5、基因的異常位點(diǎn)，再對(duì)含有突變基因的序列進(jìn)行反向測(cè)序確證該異常位點(diǎn)。⑶采用多重序列比對(duì)軟件ClustalX分析突變位點(diǎn)的保守性；用CLC Genomics Workbench7.5軟件對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；用PolyPhen-2和Mutation Taster軟件評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)突變位點(diǎn)對(duì)蛋白功能的影響（蛋白質(zhì)參考ID：P00742和蛋白質(zhì)參考轉(zhuǎn)錄本ID：ENST00000375559）；最后根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（protein databas

6、e，PDB）提供的蛋白三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)（ID：IE05.pdb），用Swiss-pdb Viewer軟件分別構(gòu)建FⅩ蛋白野生型和突變型模型，分析突變前后蛋白空間構(gòu)象及分子間作用力的變化。
　　結(jié)果：①先證者PT和APTT均明顯延長(zhǎng)（分別為67.2″/13.2″和102.9″/34″），F(xiàn)X：C為1％和FX：Ag為8%，較正常對(duì)照顯著減少；先證者父母及弟弟PT稍延長(zhǎng)，F(xiàn)X：C與FX：Ag降低至正常對(duì)照的一半左右。先證者妹妹各項(xiàng)指標(biāo)及家系

7、成員的其他凝血指標(biāo)均無明顯異常?；驕y(cè)序結(jié)果顯示先證者在F10基因8號(hào)外顯子g.27881G＞A純合錯(cuò)義突變突變導(dǎo)致298位纈氨酸（Valine，Val）突變?yōu)榧琢虬彼幔∕ethionine，Met），即p.Val298Met；先證者父母及弟弟均存在第8外顯子g.27881G＞A的雜合突變。②ClustalX軟件分析結(jié)果顯示，Val298殘基在生物進(jìn)化過程中高度保守；CLC Genomics Workbench7.5軟件分析結(jié)果表明，p

8、.Val298Met突變使FX蛋白的第274-280位及第332-336位的氨基酸二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；PolyPhen-2及Mutation Taster程序?qū).27881G>A的綜合評(píng)估提示，錯(cuò)義突變p.Val298Met會(huì)對(duì)FⅩ蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生影響；Swiss-pdb Viewer軟件對(duì)錯(cuò)義突變p.Val298Met的分析提示，該突變會(huì)引起氨基酸側(cè)鏈結(jié)構(gòu)和內(nèi)部作用力的改變。
　　結(jié)論：⑴先證者FX：C和FX：Ag均顯著降低，表現(xiàn)