Cajal間質(zhì)細(xì)胞在膀胱膽堿能神經(jīng)傳遞中作用的研究.pdf

1、背景及目的：
　　 膀胱的神經(jīng)支配相當(dāng)復(fù)雜，有不受意識(shí)控制的植物神經(jīng)，也有受意識(shí)控制的體經(jīng)因素；既有副交感神經(jīng)，也有交感神經(jīng)。當(dāng)然，膀胱的神經(jīng)支配主要為膽堿能神經(jīng)。到目前為止，有關(guān)膀胱逼尿肌收縮的神經(jīng)調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明?？傮w上，膀胱被認(rèn)為是平滑肌器官，但神經(jīng)對(duì)膀胱的功能控制卻具有類似于骨骼肌的隨意控制的特點(diǎn)；同時(shí)膀胱又具有類似于胃腸及心臟的不依賴于神經(jīng)的自主活動(dòng)特征。因此傳統(tǒng)理論將膀胱定義為介于自主和非自主神經(jīng)系統(tǒng)支配之間的特

2、殊的平滑肌器官。平滑肌細(xì)胞與神經(jīng)末梢之間沒有類似于骨骼肌的神經(jīng)-肌肉接頭這一結(jié)構(gòu)，神經(jīng)末稍與平滑肌之間也并非為一對(duì)一的關(guān)系。在這種神經(jīng)支配方式下，神經(jīng)釋放神經(jīng)遞質(zhì)通過細(xì)胞間液擴(kuò)散，進(jìn)而作用于其所支配的細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)神經(jīng)對(duì)所支配器官的功能調(diào)節(jié)。膀胱逼尿肌屬于平滑肌組織，且正常膀胱逼尿肌細(xì)胞之間的主要連接方式為中間連接，其間隙為40～70nm；很少甚至缺乏間隙為2～3nm的縫隙連接和25～30nm的橋粒連接。從而可以推測(cè)，神經(jīng)遞質(zhì)從釋放到作

3、用于逼尿肌細(xì)胞會(huì)存在時(shí)間延遲，而且因距離不等延遲的時(shí)間不同。而正常排尿時(shí)由神經(jīng)觸發(fā)協(xié)調(diào)一致的逼尿肌收縮。那么排尿時(shí)來自神經(jīng)的信號(hào)是如何迅速地傳遞至整個(gè)膀胱逼尿肌細(xì)胞，引起逼尿肌即時(shí)、協(xié)調(diào)而有力的收縮呢？神經(jīng)末梢與逼尿肌細(xì)胞之間是否存在某種傳遞信號(hào)的中間環(huán)節(jié)呢？
　　 自從發(fā)現(xiàn)膀胱內(nèi)含有Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal，ICC)以來，研究者對(duì)膀胱ICC的功能給予了極高的期待。因?yàn)樵谖改c道中

4、ICC在胃腸起搏、蠕動(dòng)和神經(jīng)傳遞等活動(dòng)中起著重要的作用，它不僅作為胃腸蠕動(dòng)基本電節(jié)律(basic electrical rhythm，BER)的起搏者，而且是壁內(nèi)神經(jīng)興奮向平滑肌傳遞的“中轉(zhuǎn)站”，并對(duì)有關(guān)信號(hào)起整合作用。那么，ICC在膀胱功能調(diào)控中會(huì)起著什么樣的作用呢？形態(tài)學(xué)研究已經(jīng)顯示膀胱ICC有樹枝狀突起，單個(gè)的或樹枝狀的突起連接成一個(gè)細(xì)胞網(wǎng)，平行分布于平滑肌細(xì)胞周圍；ICC與逼尿肌細(xì)胞和神經(jīng)末梢間均存在密切聯(lián)系，ICC與逼尿肌細(xì)胞

5、之間存在縫隙連接。因此，自主神經(jīng)系統(tǒng)、ICC和縫隙連接均參與了逼尿肌收縮的調(diào)節(jié)。膀胱ICC可能在神經(jīng)興奮從神經(jīng)傳遞到逼尿肌細(xì)胞過程中起著“中轉(zhuǎn)站”的作用。ICC要發(fā)揮“中轉(zhuǎn)站”的作用，本身必須具有較高的可興奮性。研究已經(jīng)證實(shí)膀胱ICC具有許多離子通道及膽堿能受體、嘌呤能受體等神經(jīng)受體；卡巴膽堿可以誘導(dǎo)離體培養(yǎng)的膀胱ICC細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度迅速升高，而這種細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加并不導(dǎo)致ICC收縮。因此，來自神經(jīng)的電信號(hào)就可以通過ICC網(wǎng)絡(luò)迅

6、速傳導(dǎo)至整個(gè)膀胱逼尿肌細(xì)胞，從而及時(shí)啟動(dòng)逼尿肌協(xié)調(diào)一致地收縮。實(shí)際情況是否如此？膀胱ICC在神經(jīng)末梢與逼尿肌細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞中所起作用如何？這需要進(jìn)一步深入的功能研究，也是本研究所關(guān)注的重點(diǎn)。
　　 由于膀胱ICC在體外難以純化培養(yǎng)，且體外培養(yǎng)的ICC性質(zhì)不穩(wěn)定，其理化性質(zhì)容易發(fā)生改變。所以，對(duì)ICC功能的研究就局限在原位/在體研究上，這造成對(duì)膀胱ICC的功能進(jìn)行研究比較困難。最近，Garcia-Pascual等報(bào)道了采用電場(chǎng)

7、刺激離體肌條研究尿道ICC在NO傳遞中作用及cGMP信號(hào)通路在其中的作用。研究認(rèn)為，尿道ICC是NO作用的主要靶點(diǎn)，且是通過cGMP信號(hào)通路發(fā)揮作用的。這給我們以提示：可以通過電刺激來建立膀胱功能研究模型。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)及大量的預(yù)實(shí)驗(yàn)，我們提出建立盆神經(jīng)刺激在體模型，并用于膀胱功能研究。
　　 格列衛(wèi)(甲磺酸伊馬替尼)是c-kit的特異性拮抗劑。而c-kit是ICC的一個(gè)特異性受體，對(duì)于ICC的生長、發(fā)育、分化及其生理功能具有

8、重要的調(diào)控作用。在膀胱，ICC和肥大細(xì)胞均表達(dá)c-kit，而上皮細(xì)胞、逼尿肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等均不表達(dá)c-kit。格列衛(wèi)經(jīng)靜脈注射后組織分布廣泛，許多器官包括膀胱均有分布。所以可以用格列衛(wèi)阻斷ICC功能，觀察ICC功能抑制后膀胱收縮功能變化，進(jìn)而探討ICC在膀胱功能調(diào)控中的作用。
　　 本課題目的在于：建立盆神經(jīng)刺激在體模型，并利用此模型從功能學(xué)角度觀察格列衛(wèi)對(duì)刺激盆神經(jīng)誘導(dǎo)的膀胱收縮反應(yīng)的影響；同時(shí)從形態(tài)學(xué)角度觀察ICC與膀胱

9、膽堿能神經(jīng)結(jié)構(gòu)關(guān)系；進(jìn)而從功能和形態(tài)來方面探討ICC在膀胱膽堿能神經(jīng)信號(hào)傳遞中作用。
　　 本課題以新近研究發(fā)現(xiàn)的膀胱ICC作為主要關(guān)注對(duì)象，以膽堿能神經(jīng)信號(hào)為切入點(diǎn)，從一全新的層面解讀膀胱功能調(diào)控機(jī)制，具有十分重要的理論價(jià)值，并可望為膀胱功能異常治療提供新策略。
　　 方法：
　　 本課題以60～90d齡健康SD雌性大鼠為研究對(duì)象。第一部分我們建立并優(yōu)化盆神經(jīng)刺激在體模型。
　　 第二部分我們主要從功能

10、學(xué)的角度探討ICC作為逼尿肌神經(jīng)調(diào)控的“中轉(zhuǎn)站”的可能性。我們利用盆神經(jīng)刺激在體模型，觀察阿托品對(duì)電刺激盆神經(jīng)誘導(dǎo)的膀胱收縮的影響、格列衛(wèi)對(duì)電刺激盆神經(jīng)誘導(dǎo)的膀胱收縮的影響、酮替芬對(duì)電刺激盆神經(jīng)誘導(dǎo)的膀胱收縮的影響；并利用全膀胱體外模型觀察格列衛(wèi)對(duì)外源性乙酰膽堿誘導(dǎo)的膀胱收縮的影響。
　　 第三部分我們從形態(tài)學(xué)研究ICC與膽堿能神經(jīng)結(jié)構(gòu)關(guān)系，初步探討ICC具有作為逼尿肌神經(jīng)調(diào)控的“中轉(zhuǎn)站”的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　 結(jié)果：

11、>　　 1.膀胱具有自發(fā)性收縮，0.2ml初始容量時(shí)膀胱自發(fā)收縮幅度為(4.0±0.5)cmH2O，0.4ml初始容量時(shí)膀胱自發(fā)收縮幅度為(10.1±1.0)cmH2O，而0.6 ml初始容量時(shí)膀胱自發(fā)收縮幅度為(17.9±2.3)cmH2O；三者間差異顯著(F=135，55，p=0.000)。
　　 2.隨著刺激強(qiáng)度、刺激脈寬的增加電刺激盆神經(jīng)誘導(dǎo)的最大膀胱內(nèi)壓有升高的趨勢(shì)。
　　 3.電刺激盆神經(jīng)誘導(dǎo)的最大膀胱內(nèi)壓

12、并不一直隨著刺激時(shí)間的增加而升高；刺激時(shí)間超過10s后，刺激時(shí)間延長并不能使電刺激盆神經(jīng)誘導(dǎo)的最大膀胱內(nèi)壓升高。
　　 4.間隔20分鐘，連續(xù)(6次)刺激盆神經(jīng)所誘導(dǎo)的膀胱收縮性無明顯改變。說明在實(shí)驗(yàn)所涉及的刺激次數(shù)內(nèi)，連續(xù)刺激對(duì)刺激盆神經(jīng)所誘導(dǎo)的膀胱收縮性無明顯影響。
　　 5.隨著阿托品濃度的增加，電刺激盆神經(jīng)誘導(dǎo)的最大膀胱內(nèi)壓逐漸降低趨勢(shì)，而潛伏期有逐漸延長的趨勢(shì)。即隨著阿托品濃度的增加，電刺激誘導(dǎo)的膀胱收縮性能有

13、降低的趨勢(shì)。10μmol/L阿托品對(duì)刺激盆神經(jīng)所誘導(dǎo)的最大膀胱內(nèi)壓抑制程度達(dá)85.4%。
　　 6.隨著格列衛(wèi)濃度的增加，電刺激盆神經(jīng)誘導(dǎo)的最大膀胱內(nèi)壓逐漸降低趨勢(shì)，而潛伏期有逐漸延長的趨勢(shì)；但格列衛(wèi)濃度超過1.0mmol/L以后，格列衛(wèi)濃度的增加，電刺激盆神經(jīng)誘導(dǎo)的最大膀胱內(nèi)壓降低不明顯，而潛伏期延長亦不明顯。
　　 7.100μmol/L酮替芬對(duì)電刺激盆神經(jīng)誘導(dǎo)的膀胱收縮性沒有明顯的影響。
　　 8.加入乙酰

14、膽堿可明顯誘導(dǎo)離體膀胱收縮，最大膀胱內(nèi)壓為(25.2±5.1)cmH2O；在有格列衛(wèi)存在時(shí)加入乙酰膽堿仍然可明顯誘導(dǎo)膀胱收縮，其最大膀胱內(nèi)壓為(24.7±6.0)cmH2O，兩組間差異無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.58，n=10)。
　　 9.SD大鼠膀胱肌層可見c-Kit染色陽性細(xì)胞，ICC主要分布于逼尿肌肌束邊緣及逼尿肌肌束間，呈梭形，可有突起；SD大鼠膀胱肌層可見vAChT染色陽性細(xì)胞，尤其是在逼尿肌肌束邊緣可見呈線條狀排列

15、的膽堿能神經(jīng)纖維末梢；SD大鼠膀胱內(nèi)vAChT陽性的神經(jīng)末梢和c-Kit陽性的ICC在解剖位置上緊密相鄰，c-Kit陽性的ICC細(xì)胞的突起與神經(jīng)末梢接觸緊密。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功建立盆神經(jīng)刺激在體模型，且證實(shí)本模型中電刺激盆神經(jīng)所釋放的神經(jīng)遞質(zhì)主要為乙酰膽堿，為后續(xù)膀胱功能研究提供了一個(gè)良好平臺(tái)。
　　 2.從形態(tài)和功能兩方面證實(shí)，ICC參與了膀胱膽堿能神經(jīng)對(duì)膀胱收縮功能的調(diào)控，ICC在膀胱膽堿能神經(jīng)傳