膽堿能通路在熱量限制防治腦卒中中的作用研究.pdf

1、目的：高血壓發(fā)病率高，在中國(guó)成人高達(dá)18.8％，目前我國(guó)大約有2億高血壓病人。腦卒中是高血壓病最重要的并發(fā)癥，近些年腦卒中發(fā)生率呈持續(xù)上升趨勢(shì)，且日趨年輕化，中國(guó)高血壓病人腦卒中的發(fā)生率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于歐美國(guó)家的高血壓病人。腦卒中一旦發(fā)生，后果嚴(yán)重，病人非死即殘。全球每年新發(fā)腦卒中1500萬(wàn)，其中500萬(wàn)人死亡，500萬(wàn)人永久性殘廢，要使幸存者恢復(fù)功能，耗時(shí)費(fèi)力，因此，預(yù)防和治療腦卒中已經(jīng)成為科學(xué)研究迫切需要解決的問(wèn)題。如何預(yù)防腦卒中的發(fā)生?

2、血壓水平是一個(gè)非常重要的心腦血管危險(xiǎn)因素和預(yù)測(cè)因子，血壓愈高，腦卒中的危險(xiǎn)性就愈大，且80％的腦卒中和52％的腦梗死因高血壓而引發(fā)，降低血壓可以顯著預(yù)防腦卒中的發(fā)生，但降壓治療并不是唯一的預(yù)防策略，特別是對(duì)于非高血壓性腦卒中，并且，腦卒中發(fā)生的病理生理機(jī)制復(fù)雜，有必要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究，找出除了血壓以外的其他關(guān)鍵因子或預(yù)防措施，針對(duì)這些因子或措施進(jìn)行干預(yù)，作為防治腦卒中的新靶點(diǎn)。 熱量限制(caloric restrict

3、ion，CR)是指在保證機(jī)體基本營(yíng)養(yǎng)需求前提下，降低機(jī)體約30％～40％的能量攝入。1935年McCay第一次提出了熱量限制可以延長(zhǎng)嚙齒類(lèi)動(dòng)物的壽命，隨著科學(xué)研究不斷進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)這一作用幾乎可以在所有生物中起到延長(zhǎng)壽命的作用。熱量限制可以延緩很多疾病的發(fā)生，如腎病、腫瘤、自身免疫性疾病和糖尿病等。熱量限制能降低年齡相關(guān)的神經(jīng)退化、神經(jīng)紊亂，如帕金森病或阿爾茨海默病。最近幾年有不少關(guān)于熱量限制延長(zhǎng)低等生物和細(xì)胞壽命的報(bào)道，資料顯示熱量限制延

4、長(zhǎng)壽命可能與Sir基因有關(guān)，基因家族是一類(lèi)調(diào)控壽命的重要基因，它主要通過(guò)參與染色質(zhì)沉默以及能量代謝而調(diào)節(jié)細(xì)胞的衰老過(guò)程。Sir2相關(guān)酶類(lèi)(Sirtuins)是最近發(fā)現(xiàn)的NAD+依賴(lài)的蛋白去乙?；割?lèi)，在哺乳動(dòng)物包括SIRT1-7七種不同的同系物。其中SIRT1蛋白研究最多，功能也最為明確。哺乳動(dòng)物SIRT1蛋白通過(guò)與不同的組蛋白和非組蛋白的相互作用來(lái)完成不同的功能，對(duì)細(xì)胞生存、衰老、凋亡等生理活動(dòng)起到十分重要的調(diào)節(jié)作用。我們先前的初步結(jié)

5、果顯示，熱量限制可以顯著地延緩S(chǎng)HR-SP大鼠腦卒中發(fā)生時(shí)間，延長(zhǎng)動(dòng)物壽命，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。闡明熱量限制對(duì)腦卒中的預(yù)防作用途徑對(duì)于尋找新的腦卒中預(yù)防靶點(diǎn)具有非常重要的意義。 動(dòng)脈壓力感受性反射(arterial baroreflex，ABR)功能，是心血管系統(tǒng)活動(dòng)最重要的自身調(diào)節(jié)機(jī)制之一，ABR功能強(qiáng)弱可以用壓力感受性反射敏感性(Baroreflex sensitivity，BRS)這一指標(biāo)來(lái)表示。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，AB

6、R功能的異常，參與了多種心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。因此，自上世紀(jì)80年代以來(lái)，對(duì)ABR功能的研究越來(lái)越得到人們的重視。1988年到1998年10年間，意大利學(xué)者La Rovere等用大量的臨床數(shù)據(jù)證實(shí)，BRS高低可以預(yù)測(cè)急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)，病人的預(yù)后，死亡患者的ABR功能明顯低于幸存者。同時(shí)，在腦卒中動(dòng)物模型以及慢性腦血管疾病的病人身上，也出現(xiàn)了BRS受損情況。Robins

7、on及同事也發(fā)現(xiàn)，腦卒中病人，BRS功能低下者，其預(yù)后較BRS正常者明顯要差。因此，ABR功能與腦卒中之間存在密切的聯(lián)系，是影響腦卒中預(yù)后的一個(gè)非常重要的因素。前期的研究我們已經(jīng)初步證實(shí)了ABR功能作為一個(gè)重要因子可以獨(dú)立于其他諸如血壓等因素之外來(lái)預(yù)測(cè)腦卒中的發(fā)生，改善ABR動(dòng)能，可進(jìn)一步起到預(yù)防或者延緩腦卒中的發(fā)生。那么熱量限制預(yù)防腦卒中的作用是否與ABR功能相關(guān)，如果二者有關(guān)，又是如何發(fā)揮作用的，需要我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。

8、2000年，Nature雜志報(bào)道乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)與巨嗜細(xì)胞上尼古丁受體結(jié)合能夠抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎性因子TNFα，IL-1β，IL-6，IL-18等分泌。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿的作用主要是通過(guò)與巨嗜細(xì)胞上的α7尼古丁受體結(jié)合，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)一系列的信號(hào)傳遞，最終抑制了Jak2-STAT3和NF-kB信號(hào)的激活，從而抑制了炎癥因子的產(chǎn)生。由于乙酰膽堿是迷走神經(jīng)末梢分泌的主要神經(jīng)遞質(zhì)，因此，他們把這條通路命名為“膽堿

9、能抗炎通路”(cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP)。它主要指中樞的免疫調(diào)節(jié)信號(hào)通過(guò)激活傳出迷走神經(jīng)，引起外周神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿，與免疫細(xì)胞上具有α7亞單位的N型ACh受體結(jié)合，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)抑制促炎因子的釋放，調(diào)控炎癥反應(yīng)。傳出迷走神經(jīng)能夠抑制外周炎癥因子的產(chǎn)生，提示迷走神經(jīng)與炎癥細(xì)胞間存在信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。當(dāng)機(jī)體受到傷害性刺激后，會(huì)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，并將沖動(dòng)傳到中樞。中樞再將信號(hào)投射到各個(gè)

10、迷走神經(jīng)核團(tuán)(主要為背核，疑核，孤束核等)，激活傳出迷走神經(jīng)纖維，引起外周神經(jīng)末梢釋放Ach，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制促炎因子的釋放來(lái)起到調(diào)整全身性炎性反應(yīng)的作用。Shytle等首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)腦單核巨噬細(xì)胞-小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上存在含有α7亞單位的N型受體，體外實(shí)驗(yàn)中ACh和煙堿預(yù)處理能抑制內(nèi)毒素引起的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放TNF。這一作用可被亞單位拮抗劑所抑制。此研究結(jié)果提示中樞可能也存在與外周相似的膽堿能保護(hù)通路，那么熱量限制與膽堿能通路是

11、否也有一定的聯(lián)系?本課題對(duì)以上內(nèi)容進(jìn)行了初步的探索。 方法：實(shí)驗(yàn)一：利用SHR-SP，采用大腦中動(dòng)脈栓塞方法建立腦梗塞模型，觀察不同程度的熱量限制對(duì)SHR-SP急性腦梗死損傷的保護(hù)作用差異。實(shí)驗(yàn)二，SHR-SP隨機(jī)分為2組，分別進(jìn)行去竇弓神經(jīng)(SAD)手術(shù)以及假手術(shù)(Sham)，術(shù)后再各自分為2組(自由飲食組以及熱量限制組)，觀察ABR功能對(duì)熱量限制預(yù)防腦卒中的作用影響。實(shí)驗(yàn)三，觀察熱量限制、ABR功能與乙酰膽堿及膽堿能通路的關(guān)

12、系研究：通過(guò)阿托品對(duì)SAD大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響，研究ABR功能和迷走神經(jīng)的關(guān)系；利用電生理方法研究神經(jīng)元細(xì)胞疑核放電情況并探索其與腦卒中發(fā)生的作用。實(shí)驗(yàn)四，觀察膽堿能抗凋亡通路在急性腦梗死損傷中的作用：側(cè)腦室外源性的給予新斯的明，觀察其與腦卒中發(fā)生關(guān)系；實(shí)驗(yàn)五，膽堿能通路防治腦卒中抗凋亡通路的初步探討：采用FCM觀察Cch對(duì)H2O2誘導(dǎo)的Bend．3細(xì)胞凋亡作用；用熒光顯微鏡觀察Cch對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡作用；利用分子生物學(xué)技術(shù)研究了Cc

13、h對(duì)Bend．3中SIRT1蛋白表達(dá)的影響；利用RNA干擾技術(shù)制備SIRT1屏蔽的細(xì)胞株。 結(jié)果：1、SHR-SP大鼠熱量限制40周，AL、CR組都發(fā)生腦卒中，但CR組損傷較輕；CR80％、CR60％、CR40％均可改善腦卒中發(fā)生，CR60％改善最好；大鼠SAD后，削弱了CR對(duì)腦卒中保護(hù)作用，說(shuō)明ABR功能參與了CR對(duì)腦卒中的保護(hù)作用； 2、ABR功能缺損大鼠對(duì)阿托品引起的心動(dòng)間期的反射減弱，并且通過(guò)單因素相關(guān)性分析，發(fā)

14、現(xiàn)心動(dòng)間期的差值和BRS成正相關(guān)關(guān)系；在檢測(cè)疑核放電實(shí)驗(yàn)中，SAD組疑核神經(jīng)元的放電活動(dòng)顯著降低，并且疑核放電低的易于發(fā)生腦卒中； 3、SAD術(shù)后，α7和AchT蛋白的表達(dá)均顯著降低。血清中炎癥因子IL-1β、IL-6的含量顯著升高；外源性的乙酰膽堿可延緩腦卒中的發(fā)生； 4、卡巴膽堿能劑量依賴(lài)性的抑制Bend．3和神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，并且這一過(guò)程有α7nAChR的參與；卡巴膽堿能劑量依賴(lài)性的增加SIRT1蛋白的表達(dá)。

15、 結(jié)論：1、熱量限制可以顯著地延緩S(chǎng)HR-SP大鼠腦卒中發(fā)生時(shí)間，延長(zhǎng)大鼠壽命。 2、ABR功能參與了熱量限制延緩腦卒中發(fā)生的作用機(jī)制，ABR功能缺損削弱了熱量限制延緩腦卒中發(fā)生的保護(hù)作用 3、ABR功能缺損引起迷走神經(jīng)功能減弱；而迷走神經(jīng)功能減弱大鼠易發(fā)生腦卒中，提示我們ABR功能防治腦卒中的發(fā)生伴隨著膽堿能通路調(diào)控機(jī)制； 4、膽堿能通路在急性腦梗死損傷中具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與乙酰膽堿抗神經(jīng)元和腦血