津田蕪菁花青素合成非依光型T-DNA突變體的構(gòu)建及分析.pdf

1、基因組學(xué)研究的一個(gè)重要手段是構(gòu)建大規(guī)模突變體庫(kù)，通過(guò)分析突變體的表型從而鑒定突變基因的功能是功能基因組學(xué)研究最直接有效的方法。T-DNA是目前使用最廣泛的插入元件，已在許多植物中利用其進(jìn)行突變體庫(kù)的構(gòu)建和篩選，從而研究基因的功能。本研究組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，UV-A特異誘導(dǎo)津田蕪菁膨大肉質(zhì)根表皮的花青素合成，推測(cè)在植物中可能存在不同于UV-A/藍(lán)光受體的UV-A特異的受體。津田蕪菁花青素合成非依光型T-DNA插入突變體的構(gòu)建將為研究UV

2、-A特異誘導(dǎo)花青素合成途徑中相關(guān)基因及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子建立平臺(tái)。
　　本研究制作了津田蕪菁花青素合成非依光型T-DNA突變?nèi)后w并對(duì)突變?nèi)后w進(jìn)行了初步鑒定分析。得到了以下結(jié)果:
　　成功從pBI121質(zhì)粒中克隆了GUS基因，測(cè)序分析顯示GUS基因序列全長(zhǎng)1812bp，Blast序列比對(duì)顯示序列正確。采用Gateway技術(shù)，成功構(gòu)建了表達(dá)載體pH7WG2D，1-GUS,該植物表達(dá)載體含GFP選擇性標(biāo)記基因、GUS選擇性標(biāo)記基因、潮霉

3、素植物選擇標(biāo)記以及CaMV35s啟動(dòng)子。
　　以津田蕪菁花序軸為外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的組培遺傳轉(zhuǎn)化探索，并根據(jù)蕪菁難于再分化的特性設(shè)置了35種不同6-BA和NAA組合的分化培養(yǎng)基，結(jié)果表明此種方法不能使蕪菁分化出再生芽。采用農(nóng)桿菌真空滲透萌發(fā)種子的方法進(jìn)行蕪菁非組培遺傳轉(zhuǎn)化的探索，并設(shè)置了干種子未超聲、干種子超聲、浸泡種子未超聲、浸泡種子超聲四種實(shí)驗(yàn)條件。綠色熒光蛋白篩選及GUS組織化學(xué)染色初步鑒定表明浸泡種子超聲的轉(zhuǎn)化率最高，陽(yáng)

4、性結(jié)果達(dá)到60％。
　　對(duì)T-DNA插入突變體庫(kù)進(jìn)行篩選，獲得花青素合成不受光誘導(dǎo)的全紅突變體以及花青素不合成的全白突變體。通過(guò)篩選約10000株T1代津田蕪菁，獲得200株系目標(biāo)突變體。種植篩選出的T2代突變體，共獲得17個(gè)全紅株系，60個(gè)全白株系。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了gfp、gus、hyg和35s prmoter四個(gè)標(biāo)記基因的PCR鑒定。其中全紅表型突變體3、4號(hào)，全白表型突變體7、9號(hào)四個(gè)標(biāo)記基因PCR結(jié)果均有條帶。經(jīng)TAIL