基于深度測序技術(shù)的HBV核心啟動子區(qū)和前C區(qū)突變的研究.pdf

1、目的:基于Ion Torrent PGM深度測序技術(shù)建立一種快速、敏感的乙型肝炎病毒(hepatitisB virus，HBV)突變定量檢測方法，描述HBeAg陽性慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者HBV增強子Ⅱ(enhancerⅡ，EnhⅡ)、基本核心啟動子(basal core promoter，BCP)、前C(precore，PC)區(qū)突變準(zhǔn)種特征，明確HBV病毒變異與病毒和宿主因素間的關(guān)系，探討干擾

2、素序貫治療過程中BCP突變動態(tài)演進模式及其對干擾素抗病毒治療應(yīng)答的影響。
　　方法:(1)構(gòu)建深度測序標(biāo)準(zhǔn)品:
　　克隆測序篩選HBV BCP1762/1764和PC1896突變型和野生型參考質(zhì)粒，將突變型和野生型參考質(zhì)粒按比例（0％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、25％、50％和100％）混合，構(gòu)建系列梯度的HBV突變標(biāo)準(zhǔn)品。
　　(2)構(gòu)建深度測序文庫:
　　巢式PCR擴增HBV EnhⅡ、BCP、

3、PC區(qū)片段，PCR產(chǎn)物純化，2100生物分析儀定量檢測擴增子濃度，準(zhǔn)備等摩爾比例的混合文庫，構(gòu)建測序模板，標(biāo)準(zhǔn)品及臨床樣本IonTorrent PGM深度測序。
　　(3)生物信息學(xué)分析HBV EnhⅡ、BCP和PC區(qū)突變位點及其突變率。
　　結(jié)果:(1)Ion Torrent PGM深度測序在1％-100％突變范圍內(nèi)具有較高的準(zhǔn)確性(R2＞0.99)和重復(fù)性(SE＜1％)。
　　(2)HBV EnhⅡ、BCP和PC區(qū)

4、12個突變位點的流行率達(dá)20％以上。其中，G1719T、T1753V、A1762T和G1764A與C基因型相關(guān)，而A1726C和A1752G/T與B基因型相關(guān)。15個核苷酸位點的突變引發(fā)了氨基酸改變。
　　(3)BCP A1762T/G1764A雙突變常伴PC1896野生型或低頻PC G1896A突變。
　　(4)高頻BCP A1762T/G1764A突變(≥50％)與較低的HBeAg和HBsAg水平相關(guān);PC G1896A