HBV前C-BCP區(qū)基因突變及血清sHLA-Ⅰ水平與慢性HBV感染的相關(guān)性.pdf

1、研究背景： 乙型病毒性肝炎是常見的感染性疾病之一，在世界各地均有不同程度的流行，目前世界約有3.5億人為慢性乙型肝炎(CHB)。慢性乙型肝炎是一種潛在的進(jìn)展性致死性疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織資料顯示，乙肝已成為人類第九大死因。我國是乙型病毒性肝炎的流行大國，其中HBV攜帶者約占人口的10％，即1.2億人，約占世界乙肝病毒攜帶者的1/3，而攜帶者中又有約15％～40％的感染者發(fā)展為不同類型的肝病，如活動(dòng)性肝炎、肝硬化、甚至原發(fā)性肝癌，而

2、我國乙肝的發(fā)病率還呈持續(xù)上升趨勢(shì)。 機(jī)體感染HBV后的臨床結(jié)局，多數(shù)人認(rèn)為是由病毒、肝細(xì)胞和宿主免疫系統(tǒng)相互作用決定的。HBV基因突變是影響病毒生物學(xué)特性的基本因素之一，HBV基因突變有可能改變病毒的復(fù)制能力和致病性、改變抗原表位而影響免疫應(yīng)答，進(jìn)而可能造成嚴(yán)重的肝細(xì)胞損傷等。研究表明前C/BCP(基本核心啟動(dòng)子)區(qū)突變可影響HBeAg的表達(dá)/分泌，認(rèn)為分泌型HBeAg與HBcAg有共同的抗原表位，可以減緩細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CT

3、L)對(duì)表達(dá)HBcAg的肝細(xì)胞的攻擊，故而該區(qū)突變不利于免疫耐受，與慢性肝炎的病情加重有關(guān)。但對(duì)上述觀點(diǎn)也存在爭(zhēng)議。 人白細(xì)胞抗原Ⅰ類分子(HumanleucocyteantigenⅠ，HLA—Ⅰ)是由人類主要組織相容性復(fù)合體編碼的一類糖蛋白，廣泛存在于有核細(xì)胞表面。HLA—Ⅰ抗原在免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用，是參與機(jī)體特異性免疫反應(yīng)的主要分子。正常人肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞HLA—Ⅰ表達(dá)甚微或基本不表達(dá)，當(dāng)HBV感染后，肝細(xì)胞上HLA—Ⅰ表達(dá)異常。

4、血清可溶性HLA—Ⅰ分子(solubleHLA—Ⅰ，sHLA—Ⅰ)與組織HLA—Ⅰ分子有共同的多態(tài)特異性決定簇。sHLA—Ⅰ在正常人血清中的含量很低且相對(duì)恒定，HBV感染后，血清sHLA—Ⅰ水平明顯升高。本文就HBV前C/BCP區(qū)突變和機(jī)體sHLA—Ⅰ水平解析他們與慢性HBV感染病情發(fā)展的關(guān)系；并研究他們二者的相關(guān)性。 研究對(duì)象： 本實(shí)驗(yàn)以在汾陽醫(yī)院就診的呂梁地區(qū)慢性HBV感染患者為研究對(duì)象。 目的： (

5、1)比較三種HBVDNA提取方法對(duì)PCR產(chǎn)物量的影響。 (2)探討HBV前C/BCP基因突變和血清sHLA—Ⅰ與慢性HBV感染的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的關(guān)系，并從機(jī)體免疫角度研究HBV基因突變對(duì)sHLA—Ⅰ水平的影響。 方法： (1)采集山西醫(yī)科大學(xué)附屬汾陽醫(yī)院就診的HBsAg陽性的血清133例和健康體檢者的血清20例，均于清晨空腹靜脈采集，收集臨床資料。 (2)模板制備：分別用堿裂解法、直接煮沸法、裂解液煮沸

6、法抽提患者血清中HBVDNA，比較所得DNA條帶的陽性率、光密度值，尋找合適的模板提取方法。 (3)采用巢式PCR法擴(kuò)增，HBV前C/BCP區(qū)基因組不同區(qū)段分別設(shè)計(jì)兩套引物，增加實(shí)驗(yàn)的靈敏度。 (4)采用限制性片斷長度多態(tài)性(RFLP)分析方法，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析，確定HBV的突變型、野生型和混合型。為證實(shí)該方法的準(zhǔn)確性，隨機(jī)挑取一些PCR產(chǎn)物測(cè)序。 (5)采用ELISA技術(shù)測(cè)定健康體檢者和HBV感染者血清

7、sHLA—Ⅰ水平。 (6)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0版統(tǒng)計(jì)軟件。 結(jié)果： (1)在3種不同的DNA抽提方法中，堿裂解法所得DNA條帶亮度與條帶面積均較好，陽性率高，模板量多，與其它組比有顯著差異(P＜0．01)。 (2)本地區(qū)HBV感染人群BCPT1762A1764雙突變率58.2％，PreCA1896突變率15.2％，兩組間突變率比較有顯著差異(P＜0．001)。 (3)HBeAg的表達(dá)與B

8、CP雙突變有顯著相關(guān)性(P＜0．01)，與前C區(qū)A1896突變無明顯相關(guān)性(P＞0．05)。前C區(qū)A1896突變或BCP雙突變從總體上與病情的發(fā)展有顯著關(guān)系(P＜0．05；P＜0．01)，但在慢性肝炎輕度、慢性肝炎中度和肝硬化組之間無顯著差異(P＞0.05)。 (4)血清sHLA—Ⅰ水平在慢性肝炎患者的含量明顯高于正常對(duì)照(P＜0．01)；并且隨慢性肝炎病變加重有逐漸增加的趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；無癥狀攜帶者組其含

9、量也高于正常對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。 (5)血清sHLA—Ⅰ表達(dá)與前C或BCP突變有關(guān)，突變組sHLA—Ⅰ表達(dá)明顯增加，與正常組和未突變組相比有顯著意義(P＜0．05)。 (6)將入選標(biāo)本分為HBeAg(+)組和HBeAg(—)組，血清sHLA—Ⅰ水平在e抗原陰性患者中表達(dá)較低，但兩組之間比較無顯著差異(P＞0．05)。 結(jié)論： (1)堿裂解法在血清HBVDNA抽提中的效果最好。