采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選白血病細(xì)胞株中的甲基化沉默基因.pdf

1、背景與目的：白血病是最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居兒童惡性腫瘤之首，嚴(yán)重威脅著人類健康，但白血病的發(fā)病機(jī)制還不太清楚。大量研究表明，白血病的發(fā)生發(fā)展是多因素參與、多步驟的復(fù)雜過程，涉及遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，DNA異常甲基化是人類腫瘤中最常見的基因變化之一，它作為腫瘤“二次打擊”經(jīng)典假說的重要補(bǔ)充，已成為新的腫瘤研究熱點(diǎn)之一。因此，篩選新的白血病甲基化沉默基因，將有助于揭示白血病的發(fā)病機(jī)制，為白血病的防治提供重要的理

2、論依據(jù)和科學(xué)基礎(chǔ)。 方法：應(yīng)用熒光差異雙向凝膠電泳（2-D DIGE）分離甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-雜氮-2’-脫氧胞苷（5-aza-2-dC）處理與未處理的人急性髓系白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞的總蛋白質(zhì)，Decyder和PDquest圖像分析軟件識(shí)別差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）鑒定差異表達(dá)蛋白質(zhì)，采用Western blotting和RT-PCR檢測(cè)4個(gè)差異蛋白質(zhì)（Galectin-

3、1、HSP47、S100A8、S100A9）的表達(dá)，驗(yàn)證定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果；在此基礎(chǔ)上，以4株白血病細(xì)胞系為樣本，采用甲基化特異性PCR（MS-PCR）、RT-PCR和Western blotting方法分析2個(gè)在5-aza-2-dC處理后表達(dá)上調(diào)的基因（Galectin-1、HSP47）是否為甲基化沉默基因。 結(jié)果： （1）建立了5-aza-2-dC處理與未處理的HL-60細(xì)胞蛋白質(zhì)的2-D DIGE圖譜，圖像分析

4、識(shí)別了53個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，質(zhì)譜分析鑒定了40個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中包括Galectin-1在內(nèi)的34個(gè)蛋白質(zhì)在5-aza-2-dC處理后的HL-60細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，6個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)； （2）采用RT-PCR和Western blotting方法檢測(cè)4個(gè)表達(dá)上調(diào)基因（Galectin-1、HSP47、S100A8、S100A9）在5-aza-2dC處理與未處理HL-60細(xì)胞中的表達(dá)水平，結(jié)果與定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。

5、 （3）采用MS-PCR、RT-PCR和Western blotting方法分析2個(gè)經(jīng)過表達(dá)驗(yàn)證了的基因（Galectin-1、HSP47）是否為甲基化沉默基因。MS-PCR分析結(jié)果顯示，5-aza-2dC處理4株白血病細(xì)胞系后，Galectin-1和HSP47啟動(dòng)子非甲基化水平上調(diào)，而甲基化水平下調(diào)，RT-PCR結(jié)果顯示：5-aza-2dC處理4株白血病細(xì)胞系后，Galectin-1和HSP47的mRNA和蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，提示

6、Galectin-1和HSP47基因?yàn)榘籽〖?xì)胞中的甲基化沉默基因。 結(jié)論： 1.建立了5-aza-2-dC處理與未處理的HL-60細(xì)胞蛋白質(zhì)的2-D DIGE圖譜，質(zhì)譜鑒定了40個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中34個(gè)蛋白質(zhì)在5-aza-2-dC處理后表達(dá)上調(diào)； 2.采用2D-DIGE技術(shù)與MS-PCR檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合的方法發(fā)現(xiàn)并初步證實(shí)Galectin-1和HSP47基因?yàn)槿税籽〖?xì)胞株的甲基化沉默基因，啟動(dòng)子甲基化是導(dǎo)致G