急性百草枯中毒大鼠肺組織p38MAPK、NF-κB、TGF-β-,1-、MMPs、TIMPs的變化及褪黑素的治療作用研究.pdf

1、百草枯(paraquat，PQ)，是目前世界范圍內(nèi)廣泛使用的除草劑。隨著其在我國農(nóng)業(yè)上的廣泛應(yīng)用，PQ中毒也日趨增多。PQ 經(jīng)皮膚接觸、呼吸道及消化道進(jìn)入體內(nèi)，造成急性中毒。PQ對(duì)人畜均有較強(qiáng)毒性，中毒致死劑量小，口服致死量為30-40mg/kg。PQ中毒病程進(jìn)展快且目前尚無特效解毒藥物，在臨床上病死率很高，報(bào)道可高達(dá)80％以上。肺為PQ中毒的主要靶器官，也是百草枯中毒死亡的主要原因。大劑量中毒常由于急性肺損傷所致的呼吸衰竭及心、肝、腎

2、等多臟器功能衰竭而死亡；較小劑量的中毒往往引起遲發(fā)性的肺纖維化，病程相對(duì)較長(zhǎng)，晚期多死于肺間質(zhì)纖維化所致的呼吸衰竭。 PQ的肺毒性早期表現(xiàn)為急性肺泡炎，以后表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的肺間質(zhì)纖維化。PQ引起肺損傷及后期肺纖維化的病理生理機(jī)制還未闡明。由于在PQ中毒早期主要表現(xiàn)為急性肺泡炎性改變，因此有多種促炎細(xì)胞因子參與其中，p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinasesMAPK)作為MAPK

3、家族的成員，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在炎性反應(yīng)性疾病的發(fā)生和發(fā)展中具有重要調(diào)控作用，能被多種炎性刺激所激活，參與介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、免疫反應(yīng)和細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂、死亡以及細(xì)胞問的功能同步等多種過程；而核因子kB(nuclear factor kappaB，NF-kB)是普遍存在于真核細(xì)胞中的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，最新研究發(fā)現(xiàn)NF-kB可以氧自由基激活，這種活化效應(yīng)可被抗氧化劑所抑制。近年來研究表明，肺間質(zhì)纖維化是

4、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)的過度沉積造成的，這種過度沉積不僅是由于ECM合成增多，更大程度上是ECM降解減少即合成和降解不平衡引起的。其中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)及其組織抑制因子(tissueinhibitor of metal|oproteinnase，TIMPs)在ECM合成/降解的調(diào)節(jié)過程中起著非常重要的作用，而在某些MMPs基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在

5、有NF-kB的結(jié)合位點(diǎn)。TGF-β<,1>是參與肺纖維化的細(xì)胞因子中研究最深入、作用最重要的因子。它能促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白、纖維連結(jié)蛋白、蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積；它還能減少基質(zhì)降解蛋白酶的產(chǎn)生，增加這些蛋白酶抑制物的水平，因此其在肺纖維化過程中起重要作用。褪黑素(melatonin，MT)是由松果體分泌的一種吲哚胺類激素，研究發(fā)現(xiàn)MT。具有高親脂性，因此具有高度彌散穿透能力，能在細(xì)胞膜、胞漿和細(xì)胞核中發(fā)揮抗氧化

6、作用。MT可有效清除化學(xué)反應(yīng)中的氧自由基，亦可抑制過氧化氫引起的過氧化脂質(zhì)含量的升高，還能增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶的活性，故能有效保護(hù)生物大分子如脂質(zhì)、DNA免受自由基損傷，從而對(duì)氧自由基的損傷起保護(hù)作用。是目前已知的抗氧化作用最強(qiáng)的內(nèi)源性自由基清除劑。推測(cè)MT 能減輕PQ所致組織過氧化損傷和肺纖維化形成。 p38MAPK、NF-kB、TGF-β<,1>、MMPs和 TIMPs 在PQ中毒所致肺損傷中的變化以及MT對(duì)它們的影響在國內(nèi)外尚

7、未見報(bào)道。本研究試圖通過PQ灌胃染毒制成PQ中毒模型，并給予 MT 作為干預(yù)措施，觀察其病情變化及不同時(shí)間體內(nèi)肺組織病理改變，及肺組織中p38 MAPK、NF-kB、TGF-β<,1>、MMPs與TIMPs的表達(dá)變化，了解它們?cè)赑Q中毒肺損傷中的作用，進(jìn)一步探討PQ中毒肺損傷的發(fā)病機(jī)制及MT對(duì)PQ中毒的治療作用。 本實(shí)驗(yàn)共包括三個(gè)部分。 第一部分急性百草枯中毒大鼠肺間質(zhì)改變及其調(diào)控機(jī)制 目的：觀察PQ中毒大鼠體內(nèi)

8、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活力及肺組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-1表達(dá)的變化，探討它們?cè)赑Q中毒所致肺組織損傷中的作用。 方法：選擇健康成年SD大鼠48只，隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組(A組)6只，染毒組(B組)42只。B組應(yīng)用PQ50mg/kg灌胃制作染毒模型；A組生理鹽水(NS)灌胃。分別于染毒后1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d各取6只大鼠，氯胺酮麻醉后

9、開胸，先心臟取血，測(cè)定血清MDA、SOD及GSH-Px活力；而后迅速留取肺組織，測(cè)定肺組織勻漿羥脯氨酸含量，采用 RT-PCR 法測(cè)定肺組織MMP-2、MMP-9及。TIMP-1 mRNA的表達(dá)；另取肺組織行HE染色、Masson染色、免疫組織化學(xué)染色及電鏡觀察。A組行同樣處理。 結(jié)論：1.百草枯中毒引起的肺損傷主要表現(xiàn)為早期的急性肺泡炎和以后逐漸進(jìn)展的肺間質(zhì)纖維化。 2.百草枯中毒大鼠體內(nèi)MDA含量升高、SOD及GSH

10、-Px 活力下降，說明 PQ 可引起肺內(nèi)炎性反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生的過氧化損傷及肺內(nèi)氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡是造成急性肺損傷的主要機(jī)制。 3.百草枯中毒致急性肺損傷后，肺內(nèi)MMP-2、MMP-9及 TIMP-1 的表達(dá)不同步造成ECM合成和降解不平衡，從而誘導(dǎo)肺纖維化形成。 第二部分急性百草枯中毒大鼠肺組織中NF-kB、 TGF-β<,1>及p38MAPK的變化研究 目的：觀察中毒大鼠肺組織中NF-kB活性、TGF-β<,1

11、> 及磷酸化p38MAPK的變化，探討其在急性百草枯中毒所致肺損傷中的作用。 方法：選擇健康成年SD大鼠48只，隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組(A組)6只，染毒組(B組)42只。B組于染毒后1d、3d、7d、14d、21d，28d、35d各取6只大鼠，留取肺組織。采用電泳遷移率改變分析法(EMSA)測(cè)定NF-kB 活性，Western blot法測(cè)定磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)，RT-PCR法測(cè)定MMP-2、MMP-9、TIMP-1及 T

12、GF-β<,1> mRNA 的表達(dá)；同時(shí)行免疫組織化學(xué)觀察。A組行同樣處理。 結(jié)論：本研究顯示，中毒大鼠肺組織中NF-kB、p38MAPK及TGF-β<,1>表達(dá)均明顯增強(qiáng)，與MMPs/TIMPs的異常表達(dá)及比例失衡密切相關(guān)。它們之間相互作用，互為因果，參與了肺組織的炎性損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞以及隨后的組織修復(fù)過程，從而引起肺組織損傷和肺纖維化形成。其中NF-kB和p38MAPK在中毒早期表達(dá)增強(qiáng)，可能在肺泡炎階段起重要作用；而TG

13、F-β<,1>在中毒后期仍維持高水平，與TIMP的變化一致，可能在纖維化形成過程中發(fā)揮更為關(guān)鍵的作用。 第三部分褪黑素治療急性百草枯中毒大鼠肺損傷的分子機(jī)制研究 目的：觀察褪黑素(MT)對(duì)染毒大鼠體內(nèi)MDA、 SOD、GSH-Px活力及肺組織MMPs、TIMPs、NF-kB、TGF-β<,1>及p38MAPK 表達(dá)的影響，探討MT對(duì)急性百草枯中毒的治療效果。 方法：選擇健康成年SD大鼠90只，隨機(jī)分為三組：①對(duì)照

14、組(A組)6只；②染毒組(B組)42只；③MT治療組(C組)42只：PQ灌胃染毒后，給予MT10mg/kg腹腔注射，每日一次；A組和B組每日給予等量NS腹腔注射。分別于染毒后1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d各取6只大鼠，氯胺酮麻醉后開胸，先心臟取血，測(cè)定血清MDA、SOD及GSH-Px活力；而后迅速留取肺組織，測(cè)定肺組織勻漿羥脯氨酸含量；采用RT-PCR 法測(cè)定肺組織MMP-2、MMP-9、TIMP-1及 TGF-β<,

15、1> mRNA 的表達(dá)；電泳遷移率改變分析法(EMSA)測(cè)定NF-KB活性；采用Westem blot法測(cè)定磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)；另取肺組織行HE染色、Masson染色及免疫組織化學(xué)染色。A組行同樣處理。 結(jié)論：應(yīng)用MT治療，可明顯降低百草枯中毒大鼠血清MDA含量，增加SOD及GSH-Px活力；減輕染毒大鼠肺組織早期的炎性改變及后期的肺纖維化趨勢(shì)，這可能與MT較強(qiáng)的抗氧化功能以及降低肺組織NF-kB活性，減少TGF-β<