百草枯中毒大鼠腎組織中HGF與TGF-β-,1-的表達及促肝細胞生長素的治療干預研究.pdf

1、目的：百草枯(paraquat，PQ)，是目前世界范圍內(nèi)使用廣泛的有機雜環(huán)類接觸性除草劑，隨著其在我國農(nóng)業(yè)上的廣泛應用，PQ中毒也日趨增多。PQ對人畜均有較強毒性，經(jīng)皮膚接觸、呼吸道及消化道進入體內(nèi)，造成急性中毒。中毒致死劑量小，病程進展快，且尚缺乏特效解毒劑及有效降低毒物毒性的治療手段，臨床上病死率高。PQ以原形的形式主要經(jīng)腎臟排泄，這也是導致腎臟損傷的主要原因。目前PQ經(jīng)腎臟排泄的確切機制及PQ中毒致腎組織損傷機制均尚不完全明確。本

2、研究通過觀察PQ染毒大鼠腎組織病理變化，測定血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)的變化，腎組織勻漿丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxidedismlnase，SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase，GSH-Px)的活力，并應用免疫組織化學方法觀察肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)與轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Trarlsform

3、ing growth factor-β1，TGF-β1)在PQ中毒大鼠腎組織中的表達及相互作用，以及促肝細胞生長素(Hepatocyte Growth-promoting Factors，pHGF)對上述指標的干預影響，進一步探討PQ中毒致腎損傷的機制及促肝細胞生長素對PQ中毒大鼠腎損傷的預防及治療作用。 方法：選擇健康成年SD(Sprague-Dawley)大鼠108只，隨機分為三組：①對照組(A組)36只；②染毒組(B組)3

4、6只；③pHGF治療組(C組)，36只。B、C組一次性給予25mg/kgPQ腹腔注射染毒，A組給予等量的生理鹽水腹腔內(nèi)注射，之后，C組立即給予pHGF1mg/kg腹腔注射，每12h一次，最長用藥時間為14天，B組給予與C組等量生理鹽水腹腔注射。A、B、C組分別于染毒后1d、3d、5d、7d、10d、14d各取6只大鼠，乙醚麻醉后腹主動脈取血處死，血液離心后取血清備測定血清BUN、Cr含量；而后迅速留取左腎上極組織，制成10％腎組織勻漿測

5、定MDA含量、SOD及GSH-Px活力，其余腎組織用10％甲醛固定，HE染色觀察病理學改變及免疫組織化學法觀察HGF及TGF-β1在中毒大鼠腎組織中的表達。 結(jié)果：1.大鼠中毒表現(xiàn)：大鼠于染毒后30min～2h即可出現(xiàn)中毒表現(xiàn)，B組主要表現(xiàn)為：倦怠、嗜睡、煩躁、進食水明顯減少；呼吸急促、張口呼吸、口周紫紺；血尿、少尿或無尿；走路不穩(wěn)、肢體無力、頭顫；松毛、眼鼻血性分泌物等；C組經(jīng)pHGF治療后中毒表現(xiàn)較B組減輕，呼吸困難明顯改善

6、，血尿情況改善，少尿、無尿時間均明顯縮短。 2.PQ中毒大鼠腎組織形態(tài)學變化(1)大體標本A組：正常大鼠腎臟外觀不腫，色澤正常； B組：染毒大鼠腎臟外觀腫脹，被膜緊張，顏色深呈紫黑色，表面有散在出血點； C組：pHGF干預后大鼠腎臟外觀腫脹減輕，色澤紅，表面無明顯出血點。 (2)HE染色A組(Fig.4)：腎臟各部分結(jié)構(gòu)在各時間點均無明顯病理變化； B組(Fig.5-9)：①腎小球：改變相對輕微，

7、僅為腎小球充血腫脹，炎性細胞浸潤；②腎小管：1d時腎小管部分上皮細胞水腫、空泡變性，3d時腎小管上皮細胞均見水腫、滲出、壞死，管腔內(nèi)可見紅色顆粒狀壞死物，腎小管上皮間斷性損傷部位可見再生上皮細胞；5d時腎小管上皮細胞仍有水腫、壞死，管腔內(nèi)壞死物減少；7～10d時腎小管上皮細胞水腫減輕，管腔中壞死物逐漸減少，部分腎小管損傷已修復；14d時腎小管上皮細胞水腫消退，腔內(nèi)壞死物逐漸溶解消失，腎小管上皮細胞結(jié)構(gòu)基本正常；③腎間質(zhì)：水腫、充血伴大量

8、炎性細胞浸潤； C組(Fig.10-12)：pHGF干預后明顯減輕了腎臟病理改變，加速了損傷后的修復。①腎小球：充血腫脹明顯減輕；②腎小管：1d時可見腎小管上皮細胞水腫減輕，無明顯壞死；3d時僅有小部分腎小管上皮細胞出現(xiàn)壞死，管腔內(nèi)可見少量壞死物，腎小管損傷部位可見較多再生上皮細胞；5d時腎小管上皮細胞輕度水腫，部分損傷腎小管己修復；7～10d時腎小管上皮細胞水腫消退，管腔中壞死物消失，損傷已基本修復；14d時腎小管上皮細胞結(jié)構(gòu)

9、正常。③腎間質(zhì)：可見炎性細胞浸潤。 3.血清BUN、Cr測定(table 1)A組：血清BUN、Cr各時段均在正常范圍內(nèi)； B組：BUN于第1d顯著升高，第3d達高峰，1d、3d、5d各時間點與A組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；5d后存活大鼠可逐漸下降，7～14d時段逐漸恢復正常，與A組比較無意義(P＞0.05)；A、B兩組比較Cr變化無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)： C組：BUN在1d、3d時較B組降低，具有統(tǒng)計學意

10、義(P＜0.05)，5d、7d時段仍較B組降低，但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；1d、3d時與A組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，以后各時間點與A組比較無意義(P＞0.05)；三組比較Cr變化均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 4.腎組織勻漿MDA、SOD及GSH-Px變化(table 2) 4.1 MDA測定(Fig.1，table 2)B組：染毒后1d、3d和5d各時間點MDA含量明顯高于A組(P＜0.01)，7d、

11、10d時段逐漸下降，但仍高于A組(P＜0.05)，14d時與A組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)； C組：染毒后1d、3d及5d各時間點MDA均較B組明顯降低(P＜0.05)，7～14d各時間點與B組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；1d和3d時段高于A組(P＜0.05)，其它各時間點與A組比較均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 4.2 SOD測定(Fig.2，table 2)B組：染毒后1d、3d時段SOD活力均明顯低于

12、A組(P＜0.01)，5d和7d時段仍低于A組(P＜0.05)，10d、14d及SOD活力逐漸升高，與A組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05); C組：染毒后1d、3d、5d及7d各時間點SOD活力均較B組升高(P＜0.05)；但1d與3d時明顯低于A組(P＜0.01)，其它各時間點與A組比較均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 4.3 GSH-Px活性檢N(Fig.3，table 2)B組：染毒后1 d和3d時GSH-Px活力

13、低于A組(P＜0.05)，5d及以后各時間點活力逐漸升高，與A組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)； C組：染毒后1d和3d時段GSH-Px活力較B組增高(P＜0.05)，其余各時間點與B組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；各時間點與A組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 5治療前后腎組織HGF及TGF-β1的免疫組織化學檢測結(jié)果(Table 3) 5.1HGF在大鼠腎組織中的表達與分布(Fig.13-25)A組(

14、Fig.13)：HGF僅在腎小管少許表達； B組(Fig.14-19)：于染毒后1d，即可發(fā)現(xiàn)HGF在腎小管上皮細胞的細胞核中表達，3d達高峰，與A組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，此后開始緩慢下降，5～7d仍強于A組，與A組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；10～14d以后與A組相比無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)； C組(Fig.20-25)：HGF仍主要表達于腎小管上皮細胞的細胞核中，且表達自1～7d各時間點均較B組

15、明顯增強(P＜0.01)，10～14d與B組比較仍有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；在1～7d各時間點均明顯高于A組(P＜0.01)；10～14d對與A組比較仍有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 5.2TGF-β1在大鼠腎組織中的表達與分布(Fig.26-38)A組(Fig.26)：可見TGF-β1在腎小管上皮細胞的胞質(zhì)中微弱表達； B組(Fig.27-32)：染毒后1d，TGF-β1表達明顯增強，7d達高峰，1～10d各時間點

16、與A組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；14d仍有表達，與A組相比仍有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；C組(Fig.33-38)：染毒后1d，TGF-β1在腎小管上皮細胞的胞質(zhì)中亦出現(xiàn)表達，1～14d各時間點與B組相比均減弱，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；但與A組相比，1～7d各時間點TGF-β1的表達明顯高于A組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，10～14d與A組比較仍有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 結(jié)論1.百

17、草枯腹腔注射染毒可引起腎損傷，且主要表現(xiàn)為腎小管上皮細胞損傷，表明百草枯腹腔注射染毒是制造急性腎損傷動物模型的可靠辦法； 2.百草枯中毒大鼠血清BUN于1d開始升高，3d可達高峰，7～14d可恢復正常，證實百草枯致腎損傷時可出現(xiàn)BUN改變；Cr變化無統(tǒng)計學意義； 3.百草枯中毒大鼠體內(nèi)MDA水平升高、SOD及GSH-Px活力下降，提示體內(nèi)存在過氧化損傷及氧化?？寡趸Ш猓赡苁前俨菘葜履I損傷的機制之一； 4.百草