三甲氧基二苯乙烯及其對非小細胞肺癌A549細胞的抗腫瘤作用及分子機制研究.pdf

1、肺癌是我國發(fā)病率較高的惡性腫瘤，在惡性腫瘤死亡的前列，其中80％-85％為非小細胞肺癌，因此，探討肺癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉移的機制成為目前研究的熱點。目前NSCLC的主要治療包括手術、化療、放療和分子靶向等綜合性治療。大多數(shù)NSCLC患者就診時已屬晚期，失去了手術機會，化療成為最主要的抗腫瘤治療。白藜蘆醇(3，4'，5-三羥基-反-均二苯代乙烯)是一種由植物合成的應對抗外來病原的多酚類化合物，已在多種植物中被發(fā)現(xiàn)。葡萄皮和紅葡萄酒中白

2、藜蘆醇的含量較高，而白葡萄酒中的含量極低。因此，研究者認為白藜蘆醇是“法國悖論”現(xiàn)象(盡管法國人同其他發(fā)達國家的居民一樣，攝取了大量的高脂肪、高蛋白、高熱量的食物，但他們的心血管病發(fā)病率卻比其他發(fā)達國家低得多)發(fā)生的一種關鍵物質。研究顯示，白藜蘆醇具有調節(jié)脂質代謝、抑制血小板聚集、清除自由基、抗炎、抗腫瘤等多種生物學活性和藥理作用。雖然白藜蘆醇抗腫瘤的作用近年來已經成為一個研究熱點，但是目前國內外尚無白藜蘆醇在體內、體外環(huán)境下抗腫瘤活性

3、的系統(tǒng)性研究報道，并且對于其抗腫瘤的機制也存在著多種觀點。白藜蘆醇衍生物和類似物(其中包括羥基類似物及甲基化和酯類衍生物等)與白藜蘆醇一樣具有多種生理藥理活性，其中有些化合物的活性、選擇性及穩(wěn)定性均要強于白藜蘆醇，故備受關注，成為近些年的研究熱點。為了全面了解白藜蘆醇的抗腫瘤活性，同時深入揭示其抗腫瘤作用的機制，進行了本項實驗。在一些惡性腫瘤不僅發(fā)現(xiàn)NF-κ B/Rel基因結構的改變，而且發(fā)現(xiàn)其表達及活化水平的異常。大量的研究表明，NF

4、-κ B作為轉錄因子Rel家族的重要成員，在調節(jié)免疫反應、胚胎及細胞生長、細胞凋亡、細胞周期進展、炎癥和腫瘤的形成中起著重要的作用。
　　 為了確定三甲氧基二苯乙烯是否有抗非小細胞肺癌效應，本研究用三甲氧基二苯乙烯作用于A549細胞株，觀察三甲氧基二苯乙烯對A549細胞是否具有增殖抑制、凋亡誘導和分化誘導作用；并對其分子機制進行探討。
　　 第一章、三甲氧基二苯乙烯的結構鑒定
　　 目的：對本實驗藥物TMS進行結

5、構鑒定。
　　 方法：用紫外吸收光譜檢測、紅外吸收光譜檢測、1H-NMR譜檢測、13C-NMR圖譜檢測、質譜檢測等方法對TMS進行結構鑒定。
　　 結果：TMS的紫外吸收圖譜為λmax(MeOH)：318nm，306.2nm，217.8nm，紅外光譜解析為IR v KBrmax(cm-1)：2999，2935，2836，1591，1511，1456，1H-NMR譜解析顯示結構含有3個甲氧基，13C-NMR圖譜解析為17個

6、碳信號，并且其結構中含有對稱的結構片段。質譜圖譜解析為ESI-MSm/z：271[M+H]+，256[M+H-CH3]+，241[256-CH3]+，表明分子量為270，推測分子式為C17H18O3，結構中含有甲基。樣品元素分析得分子結構式可用C17H18O3表示，結構式為()，因此可確定化合物為反-3，4’，5-三甲氧基二苯乙烯。
　　 結論：TMS的分子結構式可用C17H18O3表示，結構式為()是反-3，4’，5-三甲氧基

7、二苯乙烯。
　　 第二章、三甲氧基二苯乙烯對非小細胞肺癌A549細胞的增殖抑制效應
　　 目的：觀察三甲氧基二苯乙烯對A549細胞細胞增殖的影響。
　　 方法：用MTT試驗、集落形成抑制試驗A549細胞增殖能力，觀察不同濃度的三甲氧基二苯乙烯對A549細胞增殖的抑制率、集落形成的影響。
　　 結果：(1)三甲氧基二苯乙烯以濃度依賴性方式有效地抑制A549細胞增殖，三甲氧基二苯乙烯抑制 A549細胞活力的I

8、C50為8.6μ mol/L；(2)三甲氧基二苯乙烯能顯著抑制A549細胞集落形成，并呈量效關系；
　　 結論：三甲氧基二苯乙烯能夠有效地抑制A549細胞增殖，并呈藥物濃度和時間依賴性。
　　 第三章、三甲氧基二苯乙烯對A549細胞的凋亡誘導效應
　　 目的：確定三甲氧基二苯乙烯能否誘導A549細胞凋亡。
　　 方法：用不同濃度的三甲氧基二苯乙烯作用于A549，采用Hochest33258染色法檢測凋亡細

9、胞的百分率；用Western印跡檢測三甲氧基二苯乙烯干預后的A549細胞Caspase-3蛋白質表達。
　　 結果：(1)Hochest33258染色法證明三甲氧基二苯乙烯能以濃度依賴性方式誘導A549細胞凋亡；(2)三甲氧基二苯乙烯誘導A549細胞凋亡伴有Caspase-3蛋白表達上調和裂解激活。
　　 結論：三甲氧基二苯乙烯能以濃度依賴性方式誘導A549細胞凋亡；其誘導A549細胞凋亡的分子機制與Caspase-3蛋

10、白表達上調和裂解激活有關。
　　 第四章、三甲氧基二苯乙烯對A549細胞增殖抑制和凋亡誘導效應的分子機制
　　 目的：觀察三甲氧基二苯乙烯作用下A549細胞增殖抑制和凋亡誘導過程中NF-κ B、STAT3、STAT5b、及JAK2等增殖和凋亡相關蛋白表達水平的變化及NF-κ B細胞內分布，部分揭示三甲氧基二苯乙烯抗A549細胞作用的分子機制。
　　 方法：(1)用Western blot分析三甲氧基二苯乙烯作用下

11、A549細胞NF-K B、I K B、STAT3、STAT5b、JAK2蛋白質表達水平，(2)用間接免疫熒光技術觀察NF-κ B在三甲氧基二苯乙烯干預的A549細胞中的定位及變化。
　　 結果：三甲氧基二苯乙烯能以濃度依賴性方式抑制A549細胞NF-κ B、STAT3、STAT5b、蛋白質的表達水平，可上調I K B蛋白質表達，但對JAK2蛋白無明顯影響；NF-κ B主要分布于細胞胞漿中。
　　 結論：三甲氧基二苯乙烯的