bFGF對(duì)在鈦片上復(fù)合培養(yǎng)的成骨細(xì)胞整合素表達(dá)的影響.pdf

1、種植義齒具有良好的固位、穩(wěn)定和支持作用，且戴用舒適，近年來已經(jīng)成為修復(fù)牙列缺失和牙列缺損的主要方法之一，廣泛應(yīng)用于臨床。盡管種植義齒有諸多優(yōu)點(diǎn)，但是種植體失敗的問題在很大程度上限制了其更廣泛的應(yīng)用。骨整合理論的發(fā)展為種植修復(fù)帶來了更好的功效和更長(zhǎng)的使用壽命。骨整合理論認(rèn)為種植體的成功主要取決于種植體—組織界面的形成，而盡早、盡快在種植體與骨組織界面之間形成穩(wěn)定的骨整合已經(jīng)是臨床急需解決的問題。在此過程中，成骨細(xì)胞粘附到種植材料表面是成骨

2、細(xì)胞發(fā)揮其功能的先決條件，成骨細(xì)胞在金屬鈦表面上的粘附對(duì)骨結(jié)合界面的形成是至關(guān)重要的。成骨細(xì)胞在鈦種植表面上的粘附能力受多種因素的影響，如細(xì)胞因子以及種植材料的表面性狀的影響。本課題擬通過建立體外成骨細(xì)胞模型并從細(xì)胞以及分子水平上初步研究生長(zhǎng)因子bFGF對(duì)成骨細(xì)胞粘附功能的影響，以期找到能促進(jìn)成骨細(xì)胞與種植材料骨整合產(chǎn)生，改善組織反應(yīng)的有效措施。 本課題包括四個(gè)部分： 1．成骨細(xì)胞原代培養(yǎng) 為了獲得大量具有成骨

3、活性的成骨細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)改良了傳統(tǒng)的組織塊培養(yǎng)法，用連續(xù)植塊法對(duì)SD大鼠的顱蓋骨成骨細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。用倒置相差顯微鏡觀察原代成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)情況；并利用堿性磷酸酶染色、礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色等進(jìn)行成骨細(xì)胞鑒定；用MTT以及細(xì)胞計(jì)數(shù)來描計(jì)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示：本實(shí)驗(yàn)采用的連續(xù)植塊法操作簡(jiǎn)便，骨量消耗小，細(xì)胞產(chǎn)量大、純度高，能滿足實(shí)驗(yàn)需求。培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，經(jīng)鑒定符合成骨細(xì)胞的生物學(xué)特性，并具有良好的活性。通過成骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定和細(xì)胞倍

4、增時(shí)間的計(jì)算，測(cè)定出培養(yǎng)的成骨細(xì)胞倍增時(shí)間為2-8天，該時(shí)期為細(xì)胞增殖活躍期。實(shí)驗(yàn)中使用傳代后2-8天的成骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 2．bFGF對(duì)成骨細(xì)胞在鈦片上粘附作用的研究 利用MTT法以及掃描電鏡(SEM)觀察和分析了不同濃度的bFGF對(duì)成骨細(xì)胞在不同時(shí)間段，在鈦片上的粘附情況。用含不同濃度bFGF F12培養(yǎng)基對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行24h預(yù)孵后，將成骨細(xì)胞接種于噴砂處理的鈦片上，在0.5h，1h, 2h，4h以及8h的時(shí)間點(diǎn)利用

5、MTT法檢測(cè)成骨細(xì)胞在鈦片上粘附情況，并用掃描電鏡觀察相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)鈦片上成滑細(xì)胞粘附的形態(tài)。結(jié)果表明：成骨細(xì)胞在粘附初期的2h內(nèi)粘附速率最高，4h基本完成細(xì)胞的粘附，8h內(nèi)基本完成細(xì)胞的形態(tài)改變以及細(xì)胞的鋪展。在Ong/m1～27ng／ml濃度之間，bFGF對(duì)促進(jìn)成骨細(xì)胞在鈦片上的粘附作用具有劑量依賴效應(yīng)，27ng／mlbFGF對(duì)成骨細(xì)胞的促進(jìn)作用最為明顯。在高濃度的環(huán)境下(81ng/ml bFGF)，bFGF對(duì)促進(jìn)成骨細(xì)胞在鈦片上的粘附

6、作用有一定的抑制作用。27ng/ml bFGF能促進(jìn)成骨細(xì)胞在粘附初期的形態(tài)的改變以及在材料上的鋪展。 3．bFGF對(duì)成骨細(xì)胞整合素mRNA表達(dá)水平的影響 用含不同濃度bFGF F12培養(yǎng)基對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行24h預(yù)孵后，將成骨細(xì)胞接種于噴砂處理的鈦片上，在1、3、5天收集所培養(yǎng)的成骨細(xì)胞。利用RT-PCR定量免疫熒光的方法檢測(cè)成骨細(xì)胞整合素亞基α<,2>、α<,5>、β<,1>mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明：體外培養(yǎng)的大鼠

7、成骨細(xì)胞膜上均能持續(xù)表達(dá)整合素α<,2>，α，β<,l>。Itgβ<,1>表達(dá)水平最高，其次為Itgα<,2>，Itgα<,5>相對(duì)最低。本實(shí)驗(yàn)中9ng/ml,27ng／mlbFGF預(yù)孵成骨細(xì)胞后，不同程度有效上調(diào)了成骨細(xì)胞Itgα<,2>，Itgβ<,1>和Itgα<,s> mRNA的表達(dá)水平。在本實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間階段中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Itgα<,2>，Itgβ<,1>和Itgα<,5>mRNA的表達(dá)水平有一定程度的增長(zhǎng)。 4.b

8、FGF對(duì)成骨細(xì)胞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)變化的影響 用含不同濃度bFGF F12培養(yǎng)基對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行24h預(yù)孵后，將成骨細(xì)胞接種于噴砂處理的鈦片上，在1、3、5天收集所培養(yǎng)的成骨細(xì)胞。利用激光共聚焦顯微鏡以及免疫熒光的方法對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察以及熒光定量檢測(cè)。結(jié)果表明：成骨細(xì)胞中的微絲骨架呈纖維狀，以與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行的方向排列，占據(jù)了細(xì)胞胞漿中，能粗略反映成骨細(xì)胞的輪廓。9ng/ml和27ng/ml bFGF預(yù)孵成骨細(xì)胞，能增加成骨細(xì)胞中