抗山羊傳染性胸膜肺炎支原體PG-,3-單克隆抗體的制備及研究.pdf

1、目的；使用本實(shí)驗(yàn)室研制的改良型固體Hartleys培養(yǎng)基培養(yǎng)絲狀支原體山羊亞種PG3株，獲得菌體經(jīng)凍融裂解制備抗原；通過(guò)動(dòng)物免疫、間接ELISA方法建立、細(xì)胞融合、陽(yáng)性克隆篩選、亞克隆，獲得能分泌抗體的單克隆細(xì)胞株；制備、純化腹水，進(jìn)行效價(jià)和特異性鑒定，以獲得效價(jià)高、特異性強(qiáng)的單克隆細(xì)胞株；為研究絲狀支原體山羊亞種表面抗原結(jié)構(gòu)、篩選保護(hù)性抗原奠定基礎(chǔ)；同時(shí)以單克隆抗體為包被原，山羊抗PG3純化多抗為夾心抗體，建立雙抗夾心ELISA方法，

2、為山羊傳染性胸膜肺炎的診斷、流行病學(xué)調(diào)查建立一種簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的方法。 方法；結(jié)合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的具體情況，使用本實(shí)驗(yàn)室研制成功的“改良型Hartleys培養(yǎng)基”進(jìn)行絲狀支原體山羊亞種PG3的復(fù)蘇和擴(kuò)大培養(yǎng)；從固體培養(yǎng)基上洗脫菌體，經(jīng)低速離心去除沉淀，上清液高速離心獲得菌體，使用PBS洗滌三次，-20℃凍融裂解后低速離心棄除沉淀，獲得上清即為膜蛋白，測(cè)定蛋白含量。將所得膜蛋白以一定量與弗氏佐劑混合充分

3、乳化，免疫BALB/c小鼠，330μg/只，共免疫四次；采血測(cè)定血清抗體效價(jià)并建立間接ELISA方法，待血清效價(jià)大于1∶5000時(shí)進(jìn)行細(xì)胞融合。取血清效價(jià)高的BALB/c小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在50％PEG1500的作用下進(jìn)行細(xì)胞融合；使用已建立的間接ELISA進(jìn)行篩選，陽(yáng)性孔采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆；得到的單克隆細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大凍存及腹水制備。腹水進(jìn)行效價(jià)測(cè)定、特異性檢測(cè)；使用試劑盒測(cè)定其抗體亞型，進(jìn)行抗體純化、純度檢測(cè)。以純

4、化的單抗包被酶標(biāo)板、純化山羊抗PG3多抗作為夾心抗體，建立雙抗夾心ELISA方法并進(jìn)行特異性、靈敏度檢測(cè)及初步應(yīng)用。 結(jié)果；絲狀支原體山羊亞種PG3在改良型Hartleys培養(yǎng)基得到成功復(fù)蘇和擴(kuò)大培養(yǎng)，膜蛋白質(zhì)含量為1.65mg/mL；四次免疫后小鼠抗體效價(jià)達(dá)到1∶6400以上。以50％PEG1500進(jìn)行細(xì)胞融合，融合孔為364孔，融合率達(dá)到75.8％；經(jīng)間接ELISA篩選，共得31個(gè)陽(yáng)性孔，陽(yáng)性率為8.5％，兩次亞克隆后得到四

5、株單克隆細(xì)胞株：1C10、1E2、2E8、2F12，經(jīng)腹水制備、效價(jià)檢測(cè)、特異性檢測(cè)最終得到1E2株，其抗體亞型為IgG3、κ型，SDS-PAGE檢測(cè)純度較高。建立的雙抗夾心ELISA單抗包被濃度為1∶200稀釋(20μg/mL)，山羊抗PG3多抗工作濃度為1∶400稀釋，其檢測(cè)下限為2μg/mL，檢測(cè)豬肺炎支原體、雞滑液支原體、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、馬血清等均為陰性。使用雙抗夾心ELISA和間接ELISA對(duì)12份

6、有臨床癥狀山羊的鼻腔拭子、血清進(jìn)行檢測(cè)，前者陽(yáng)性率為58.3％，后者陽(yáng)性率為66.7％；對(duì)于其中癥狀典型的5只，雙抗夾心ELISA檢測(cè)全為陽(yáng)性，陽(yáng)性率100％，間接ELISA陽(yáng)性為3只，陽(yáng)性率60％。僅偶見干咳的7只，雙抗夾心ELISA檢測(cè)出2只陽(yáng)性，陽(yáng)性率28.6％，間接ELISA法檢測(cè)出5只陽(yáng)性，陽(yáng)性率71.4％。 結(jié)論；使用改良型Hartleys培養(yǎng)基及凍融法成功地獲得了PG3膜蛋白，通過(guò)動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、間接ELISA